Янчанг Уей

От ‡ Държавна ключова лаборатория по репродуктивна биология, Институт по зоология, Китайска академия на науките, Пекин 100101, Китай,

обогатена

Cai-Rong Yang

От ‡ Държавна ключова лаборатория по репродуктивна биология, Институт по зоология, Китайска академия на науките, Пекин 100101, Китай,

Ян-Пинг Уей

§ Отдел по акушерство и гинекология, Народна болница Чанги, Weifang 261300, Китай,

Жао-Джиа Ге

От ‡ Държавна ключова лаборатория по репродуктивна биология, Институт по зоология, Китайска академия на науките, Пекин 100101, Китай,

Жен-Ао Жао

От ‡ Държавна ключова лаборатория по репродуктивна биология, Институт по зоология, Китайска академия на науките, Пекин 100101, Китай,

Бинг Джанг

Key Китайска академия на науките Ключова лаборатория за геномни науки и информация, Пекински институт по геномика, Китайска академия на науките, Пекин 100029, Китай, и

Yi Hou

От ‡ Държавна ключова лаборатория по репродуктивна биология, Институт по зоология, Китайска академия на науките, Пекин 100101, Китай,

Хайде Шатън

‖ Катедра по ветеринарна патобиология, Университет на Мисури, Колумбия, Мисури 65211

Цин-Юан Слънце

От ‡ Държавна ключова лаборатория по репродуктивна биология, Институт по зоология, Китайска академия на науките, Пекин 100101, Китай,

Резюме

Въведение

Експериментална схема. Контролираните или предизвиканите от ЕЕ женски жени са били чифтосвани с мъже. Потомци на майки за отслабване показват подобрено общо здраве, като намалено телесно тегло и натрупване на мазнини и повишен глюкозен толеранс и чувствителност към инсулин. Профилирането на генната експресия разкрива кохерентно регулиране на гените, участващи в биосинтеза на липиди и холестерол. Последователно при тези животни се наблюдават диференциални модели на метилиране. Загубата на тегло при майките е променила епигенетичните белези в зрелите яйцеклетки, което може да допринесе до голяма степен за метаболитните и епигенетични промени в потомството.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОЦЕДУРИ

Обогатен протокол за околната среда
Профилиране на изразяване на микрочипове

Общата РНК беше извлечена от средния лоб на черния дроб с помощта на реагент TRIzol (Invitrogen). Проби от пет контролни и четири потомци за отслабване, всеки от независима майка, бяха избрани за анализ на микрочипове, използвайки NimbleGen Mouse Gene Expression 12 × 135K Array (Roche NimbleGen), съгласно инструкциите на производителя. За анализ на данните е използвана поредица от софтуер (софтуер NimbleScan и софтуер Agilent GeneSpring GX). След настройка и нормализиране чрез метода за силен многочипов анализ, данните бяха анализирани чрез софтуер за анализ на значимостта на микрочипове (SAM) (25). Всички данни от масиви и допълнителни подробности за проби и анализи са достъпни в Omnibus на Gene Expression (GEO) под номер за присъединяване> GSE40479. Диференциално експресираните гени бяха определени въз основа на кратна промяна> 2 при корекция на фалшивото откритие от 5%. Диференциално експресираните гени бяха функционално анотирани според термините на генната онтология или пътищата на Киото енциклопедия на гени и геноми, използвайки DAVID (база данни за анотации, визуализация и интегрирано откриване). Освен това, диференциално експресираните гени са били йерархично групирани с помощта на Cluster 3.0.

Количествена PCR в реално време (qRT-PCR)

Анализирахме нивата на иРНК чрез qRT-RCR след обратна транскрипция, както е описано по-горе (26). За чернодробните тъкани общата РНК се извлича от средния лоб на черния дроб, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen) и се определя количествено чрез абсорбция при 260 и 280 nm в спектрофотометър PerkinElmer Life Sciences. След това беше използван като шаблон за допълнителен синтез на ДНК (cDNA) чрез синтеза на първа верига SuperScript III (Invitrogen) със случайни хексамери. За ооцитите амплификацията на малки количества от кДНК на клетките се основава на предишен протокол (27). Количеството на иРНК се определя с количествената RT-PCR система на Roche LightCycler 480 II (Roche Applied Science), като се използват последователности от праймери, обобщени в допълнителен набор от данни S1 и SYBR Green SuperMix-UDG (Invitrogen). PCR се извършва в краен обем от 25 μl, състоящ се от разредена cDNA проба, 1 × SYBR Green Mix (Invitrogen), праймери, оптимизирани за всеки целеви ген, и вода без нуклеаза. PCR състоянието е 40 цикъла при 95 ° C за 30 s, 55 ° C за 1 min и 72 ° C за 30 s. Нивата на генната транскрипция са нормализирани към домакинския ген β-актин. Резултатите са изразени като 2 - (целеви брой цикли на гена - брой цикли на актин). Имайте предвид, че за Lpin1, за анализ беше използвана β изоформата (вариант на препис 2, номер за присъединяване на GenBank TM> NM_015763.4).

Профилиране на ДНК метилиране
Бисулфитно секвениране

Бисулфитното геномно секвениране се извършва, както е описано по-горе (29). Модификацията на бисулфит е извършена с помощта на EZ ДНК метилиращ комплект (Zymo Research). След това преобразуваната ДНК се амплифицира чрез PCR с праймери, обобщени в допълнителен набор от данни S1. Получените PCR продукти се пречистват с помощта на комплект за екстракция на гел MinElute (Invitrogen) и се клонират в pMD18-T Vector (Takara). Отделни клонове бяха отгледани и плазмидите бяха пречистени с помощта на PureLink Miniprep кит (Invitrogen). Положителните клонинги бяха потвърдени чрез PCR и не по-малко от 10 клони, произволно избрани за всеки субект, бяха секвенирани с помощта на автоматичен секвенсор (ABI PRISM-77). Резултатите от секвенирането бяха анализирани с помощта на MethTools 2.0. Областите, които бяха изследвани чрез бисулфитно секвениране, са както следва: Hmgcr, Chromosome 13: 97441152–97441498; Lss, хромозома 10: 75994273–75994536; Sqle, хромозома 15: 59146023–59146335; и Lpin1, хромозома 12: 16596388–16596703.

mRNA-Seq

За mRNA-Seq за анализ се използва обединена mRNA от три животни (еднакво от всяко животно) за всяка група и се оценява средното ниво на експресия за всяка група. Накратко, естествено овулирали зрели ооцити (метафаза на втората мейоза (MII етап)) бяха събрани от трима контролни и три EE женски F0 основатели (три ооцита на мишка, девет ооцити за всяка група). Кумулусните клетки бяха отстранени от ооцитите чрез третиране с хиалуронидаза. Усилването на малки количества от кДНК на клетките се основава на предишен протокол (27). СДНК се амплифицират равномерно чрез PCR в продължение на 20 цикъла. Библиотеките бяха пречистени и секвенирани на система за секвениране на Applied Biosystems SOLiD. Данните за секвениране бяха картографирани в генома на мишката, за да се извлече цялата информация за транскриптома на ооцитите. Картираните данни за четене се анализират от пакета DEGseq, както е описано по-горе (30). Откритите гени със съответстващ брой на четене по-голям от 200 бяха избрани за допълнителен анализ. Методът за селектиране на промяна с кратна промяна се използва за диференциално експресирана генна селекция. Гените със стойности на log2 по-големи от 0,584 или по-малко от -0,584 (промяна с кратно> 1,5) се считат за регулирани съответно нагоре или надолу, съответно.

Трансфер на ембриони

Естросните жени, основатели на F0, са били чифтосвани с мъже. Успешното чифтосване се определя от присъствието на вагиналната запушалка, а сутринта на присъствието на вагиналната запушалка е определен на 0,5 ден. Ембриони в едноклетъчен стадий на ден 0,5 се получават от контролни или ЕЕ женски и след това се прехвърлят в яйцепроводи от псевдо бременни женски на ден 0,5, съответно. Бременните женски остават сами в стандартни условия, докато котилата им навършат 3 седмична възраст. Включени са само майки с размери на постелята 8–12, а постелките са стандартизирани до 10 малки на 1 ден в рамките на майчините групи, за да се избегне хранителен дисбаланс. Едно потомство на произволно избрана майка е използвано за метаболитни и молекулярни изследвания, както е описано за естествено оплодени животни. За бластоцисти, използвани за последователност на бисулфит, ембрионален ден (Е) 3.5 бластоцисти са събрани на ден 3.5 чрез промиване на яйцепровода с М2 среда. Всяко третиране с бисулфит се извършва върху 18 събрани бластоцисти, получени от три животни (шест бластоцисти, произволно избрани от всяко животно) за всяка група.

Съзряване на ооцитите in vitro

Яйчниците бяха изолирани от 3-месечни женски мишки 46–48 часа след интраперитонеално инжектиране на 10 международни единици (IU) серумен гонадотропин на бременна кобила. След това яйчниците се поставят в чаша на Петри с предварително затоплена среда М2, допълнена с 2,5 μm милиринон, за да се предотврати разграждането на зародишните везикули. Кумулусните ооцитни комплекси се възстановяват от яйчниците чрез многократно пробиване на антрални фоликули с фина стоманена игла под зрителното поле на дисектиращ микроскоп. След трикратно измиване в среда М2, кумулусните ооцитни комплекси се култивират за узряване в среда на база М16 (съдържаща 10% FBS), допълнена с или без глюкоза (5 mm), инсулин (5 μg/ml) или лептин (10 ng/ml), съответно. Всички експерименти с култивиране на ооцити се провеждат под минерално масло при 37 ° С във влажна атмосфера от 5% CO2 във въздуха в продължение на 16 часа. Кумулусните клетки бяха отстранени от ооцитите чрез третиране с хиалуронидаза, а ооцитите с първо полярно тяло бяха използвани за по-нататъшни изследвания.

Статистически анализи

РЕЗУЛТАТИ

EE-индуцираното отслабване на майката води до физиологични и метаболитни промени в потомството

Жените основатели на F0 са отгледани за първи път в стандартна лабораторна среда от отбиване до 12-седмична възраст, след което са били произволно поставени в ЕЕ клетки или държани в нормални клетки в продължение на 4 седмици. И контролните, и ЕЕ мишките имаха свободен достъп до нормална диета и вода. След 4 седмици EE, жените основатели на F0 показват ∼17% намаление на телесното тегло в сравнение с контролите (фиг. 2, A-D и допълнителен набор от данни S2). Съответно жените основатели на EE F0 показаха намалена WAT маса и нива на глюкоза в плазмата, инсулин, лептин, холестерол и триглицериди (фиг. 2, D и E и допълнителен набор от данни S2). Не са наблюдавани промени в енергийния прием между EE мишки и контролите (Фиг. 2 F), което показва, че намалените мазнини, наблюдавани при EE мишки, се дължат на увеличения разход на енергия. Освен това, при GTT и ITT, мишките с EE показаха подобрен глюкозен толеранс, както и повишена чувствителност към инсулин в сравнение с контролите (Фиг. 2, G – I).

За по-нататъшно изследване на връзката между експресията на чернодробните гени и физиологията, ние изследвахме нивата на холестерола и триглицеридите в черния дроб, за да определим дали диференциалните нива на експресия на гените, свързани с липидния метаболизъм, са свързани с промени в нивата на липидите. Чернодробният липиден анализ показва драстично намаляване на нивата на холестерол и триглицериди в черния дроб при потомство за отслабване (Фиг. 5 Д и допълнителен набор от данни S2). Като цяло тези молекулярни находки са в съответствие с физиологичните и метаболитните промени.

Загубата на тегло при майките променя моделите на метилиране на липидните метаболитни гени при потомството
Краткосрочната ЕЕ няма ефект, подобен на стандартната ЕЕ

Промени в метаболитната и генната експресия в потомството, получени от ембриотрансфер. A, телесно тегло и тегло на WAT (контрол и EE, n = 8 и 8, съответно). За простота, за A-C, тук са представени само женски потомци, но данните, свързани с мъжете, са налични в допълнителен набор от данни S2. В, серумни биомаркери (n = 8 и 8, съответно). С, нивата на чернодробния триглицерид и холестерола (п = 8 и 8, съответно). D, кръвна глюкоза по време на GTT (n = 6 и 8 съответно). E, кръвна глюкоза по време на ITT (n = 8 и 7, съответно). F, експресия на гени, участващи в биосинтеза на холестерол в черния дроб на потомството на 3-седмична възраст (съответно n = 6 и 6). G, експресия на гени, участващи в липидния метаболизъм в черния дроб на потомството на 3-седмична възраст (n = 6 и 6, съответно). Данните са изразени като средно ± S.E. (ленти за грешки). За единични точкови измервания звездичките показват значителна разлика между групите: *, p Фиг. 9 A и and 10 10 A), за които е установено, че са хиперметилирани в черния дроб на потомството за отслабване. Също така открихме значително намаляване на метилирането в промоторната област на Lpin1 в ооцитите от майки за отслабване (Фиг. 9 Б). За разлика от това, метилирането на Sqle е непроменено между контролните ооцити и загубата на тегло (фиг. 10 Б), което показва, че диференциалното метилиране в този локус, наблюдавано в черния дроб, се установява в някакъв момент по време на развитието. За да проверим дали гените, диференциално метилирани, са ново метилирани или потенциално наследяват ДНК метилиране от ооцити, извършихме последователност на бисулфит върху бластоцисти Е3.5 след ембриотрансфер на оплодени яйцеклетки. Както Hmgcr, така и Lss показват по-високи нива на метилиране в проби за отслабване в сравнение с контролите (фиг. 9 А и и 10 10 А), а Lpin1 показват по-ниски нива на метилиране в проби за отслабване в сравнение с контролите (фиг. 9 Б), което предполага, че тези гените частично наследяват метилирани алели от ооцити. Заедно тези резултати показват, че за определени гени или региони състоянието на метилиране на цитозина в ооцитите е силно предразположено към метилиране в бластоцисти, може би чрез непълно деметилиране на метилирани цитозини след наторяване.

Загубата на тегло при майките променя цялостните модели на транскрипция при зрели яйцеклетки

Загубата на тегло при майката променя цялостните модели на транскрипция при зрели яйцеклетки. А, количествено определяне и валидиране на експресията за посочените гени. qRT-PCR е извършена за посочените гени и съотношенията загуба/тегло са показани като log2. Същите проби, използвани за mRNA-Seq, бяха използвани за qRT-PCR изследването. Всеки анализ се повтаря в три екземпляра и S.E. се показва като грешки. B – E, експресия на Apoe (B), Mapk3 (C), Hdac4 (D) и Carm1 (E) в ооцити от допълнителни шест стандартни EE, шест краткосрочни EE и пет контролни животни, които не са включени в иРНК-Seq проучване. Всяка лента представлява независима мишка. За всяка мишка бяха използвани три до пет събрани зрели яйцеклетки за qRT-PCR анализ. Всяка проба беше анализирана в три екземпляра и S.E. се показва като грешки. Пунктираната линия представлява праговата стойност за генна експресия на промяна в пъти повече от два пъти от нормалното ниво.

Ефекти от загубата на тегло при майката върху метаболитните и молекулярните промени в поколението F2

Потенциален механизъм на индуцирани от загуба на тегло епигеномни промени в ооцитите. Развиващите се яйцеклетки се суспендират във фоликуларна течност, която осигурява уникална хранителна микросреда, която представлява метаболитните състояния на майката, например липиди и биомаркери. По време на узряването на яйцеклетките се установяват епигенетичните му белези до крайната фаза на узряване преди овулацията. Екологичните сигнали, които варират в зависимост от метаболитните условия на майката, могат да навлязат в ооцита и да доведат до епигеномни промени в ооцитите.

Ефекти от различни добавки по време на ин витро зреене на ооцитите върху експресията на Dnmt3a и Dnmt3l. A, за да се потвърдят данните за RNA-Seq, количествената RT-PCR е извършена върху Dnmt3a и Dnmt3l по отношение на домакинския ген β-актин, който показва подобна разлика в експресията между групите в сравнение с данните за RNA-Seq. В, ефекти на добавянето на глюкоза върху експресията на Dnmt3a и Dnmt3l. С, ефекти на инсулиновите добавки върху експресията на Dnmt3a и Dnmt3l. D, ефекти на добавката на лептин върху експресията на Dnmt3a и Dnmt3l. Всеки експеримент се повтаря в три екземпляра. Данните са изразени като средно ± S.E. (грешки). Пунктираната линия (зададена като 1) представлява средната стойност на нивата на експресия на всеки ген от контролите. *, p * Тази работа е подкрепена от Националната фондация за естествени науки на Китай Grant 3147055 и Националната програма за основни изследвания на China Grants 2012CB944404 и 2011CB944501.

Тази статия съдържа допълнителни набори от данни S1 – S7.