Отворена биология

  • Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Обобщение

Изследвано е използването на системата за маркиране на видимия имплант еластомер (VIE) при зебра (Danio rerio). Бяха тествани две ориентации на маркера (хоризонтална и вертикална) в основата на гръбната перка за задържане на етикета, фрагментация на маркера и дали VIE маркерите влияят върху растежа и оцеляването на младите риби зебра (1–4 месеца след излюпването). Шест местоположения на етикети (корем, основа на анален перка, опашен дръжка, основа на гръбна перка, основа на гръдни перки, провлак) и 5 ​​цвята на етикета (жълт, червен, розов, оранжев, син) бяха оценени за лекота на приложението на етикета VIE и видимостта на маркера в възрастен данио. Дългосрочно задържане (1 година) и множество места за маркиране (отдясно и отляво на основата на гръбната перка и гръдната перка) бяха изследвани при възрастни риби зебра. И накрая, оцеляването на рекомбинационния активиращ ген 1 -/- (rag1 -/-) риба зебра беше оценено след VIE маркиране.

еластомерни

Най-доброто местоположение на етикета беше основата на гръбната перка, а най-видимият цвят на етикета беше розов. Темпът на растеж на младите риби зебра не е бил повлиян от маркирането на VIE. Препоръчва се хоризонтално маркиране в ранните етапи на растеж на рибите (1-2 месеца след излюпването). VIE таговете са запазени в продължение на 1 година и маркирането не пречи на дългосрочния растеж и оцеляване. Не е имало смъртност, свързана с маркиране на VIE при rag1 -/- риба зебра.

Системата за етикетиране VIE е изключително подходяща за малки по размер зебра. Когато са запознати с процедурата, 120 възрастни риби зебра могат да бъдат маркирани за един час. Това не увеличава смъртността при възрастни зебра и не пречи на растежа при млади или възрастни риби зебра.

Въведение

Материали и методи

Грижа за животните

Див тип и парцал1 -/- мутант риба зебра (щам Тюбинген) са настанени в люпилнята за специфични патогени (SPF) на Държавния университет в Мисисипи (MSU-CVM) (Hohn and Petrie-Hanson, 2007; Petrie-Hanson и др., 2009). Размножаването на рибите се извършва съгласно модифицирани стандартни протоколи, публикувани на http://www.cvm.msstate.edu/zebrafish/index.html. Институционалният комитет за грижи и употреба на животните в Държавния университет в Мисисипи одобри всички протоколи за експериментални животни.

Във всички опити зебрафите са анестезирани в 110 mg/L буфериран трикаин метан сулфонат (MS222). Видимите етикети на еластомерни импланти се инжектират с помощта на инсулинова спринцовка. След възстановяване от анестезия, рибите бяха преместени в резервоари от 20 L в водна система (приблизително 0,5 L min -1) и поддържани при 27 ± 1 ° C. Резервоарите бяха аерирани, за да поддържат нивата на кислород между 6,0 и 6,5 mg L -1. Тъй като иглените рани отнемат няколко дни, рибите не са обработвани за препоръчаното време от поне 10 дни след инжектирането на VIE (Northwest Marine Technology, Inc., 2006, „Маркиране на малки риби с видим имплант еластомер“, http: // www .nmt.us/support/appnotes/ape03.pdf). Всички риби са държани при едни и същи условия по време на всички експерименти и са наблюдавани 3 пъти на ден за загуба на етикет и здравословно състояние. Умиращите риби бяха евтанатизирани в 340 mg/L MS222 и смъртността беше регистрирана по време на експеримента.

VIE тагове

Комплект за ръчно инжектиране (60 ml) за етикети VIE е закупен от Northwest Marine Technology, Inc. (Shaw Island, WA, USA, http://www.nmt.us). Еластомерът е приготвен съгласно инструкциите на комплекта за минимален обем (смесване на малки количества VIE) (Northwest Marine Technology, Inc., 2011, „Системи за ръчно инжектиране на еластомер. Инструкции за 10: 1 видим имплант еластомер“, http: //www.nmt .us/products/vie/manual_vie_instructions.pdf). Малко количество еластомер от всяка смесена партида се експресира върху алуминиево фолио, за да се определи правилното втвърдяване. За да се предотврати загубата на етикет VIE, иглата на спринцовката се вкарва с 2 мм по-дълбоко в тъканта, след което се измерва предвидената дължина на етикета от еластомера, еластомерът се изтегля и иглата се прибира до около 1 мм преди мястото на инжектиране и иглата се изтегля от напускащата риба най-малко 1 mm след мястото на инжектиране без еластомер. В опит 4 и 5 са ​​регистрирани VIE инжекционни времена. Времето за инжектиране на VIE включва улавяне на рибата, маркиране на рибата и пускането й обратно в резервоара.

Проба 1: Местоположение на етикета VIE

За да се определят оптималните места за маркиране, групи от 10 възрастни риби зебра са имплантирани с 4 мм лента от розов еластомер на едно от следните места: корем, основа на аналната перка, опашен дръжка или основа на гръбната перка и с 2 мм лента от розов еластомер в основата на гръдната перка или провлака (фиг. 1). Групите риби се държат в продължение на 20 дни, след което се определя задържане на етикети на всеки обект. Местоположението на етикета се оценява чрез лекота на нанасяне на еластомера (лесно/трудно), задържане на етикета (маркерът е запазен/етикетът е частично запазен/етикетът е изгубен) и заздравяването на рани (напълно излекувано/не е напълно излекувано).

VIE етикетите се оценяват на шест позиции в риба зебра, както е показано със стрелки.

Опит 2: Цвят и видимост на етикета VIE

За да се определи оптималният цвят на етикета, 2 места за инжектиране (основата на гръбната перка и основата на гръдните перки) бяха оценени поотделно с 10 възрастни риби зебра на място и цвят (жълт, червен, розов, оранжев, син). Рибите се имплантират с приблизително 4 mm еластомер от един цвят в основата на гръбната перка или с приблизително 2 mm еластомер в един цвят в основата на гръдната перка. Рибните групи се провеждаха в продължение на 20 дни, след което се определяше видимостта на цвета на етикета на всеки обект.

Проба 3: Проучване на растежа

Фрагментацията, лошата видимост и загубата на етикети от еластомер са най-вероятни по време на основната фаза на растеж на рибите (Astorga et al., 2005). При зебрата основната фаза на растеж е между излюпването и 3 месеца след излюпването (mph). VIE етикетите се инжектират в 1 mph, 2 mph и 3 mph млади и зебрафи се оценяват за фрагментация на маркера (брой фрагменти), задържане на етикет (запазен етикет/загубен етикет) и растеж, тегло и оцеляване на рибите. Тъй като рибите растат по дължина и ширина, бяха оценени хоризонтални и вертикални маркери в основата на гръбната перка. За всяко третиране, 30 риби се инжектират с хоризонтални (5 mm) VIE маркери, 30 риби се инжектират с вертикални (3 mm) VIE етикети и 30 риби служат за контрол. Дължината и теглото на рибите бяха определени в началото и в края на експеримента. Десет риби на резервоар бяха държани за един месец.

Проба 4: Проучване за дългосрочно задържане

За да се определи дългосрочното задържане на етикети VIE, 50 женски и 50 мъжки възрастни риби зебра са инжектирани в основата на гръбната перка с розов еластомер и 50 женски и 50 мъжки риби служат за контрол. Дължината и теглото на рибите бяха определени в началото и в края на експеримента. Записаха се времето за инжектиране и количеството еластомер. Рибите се държат в продължение на 1 година като разплод и се отглеждат два пъти месечно. Оцеляването и задържането на етикети са регистрирани след една година.

Опит 5: Множество сайтове за маркиране

За да се определи преживяемостта и растежа на възрастни риби зебра, маркирани на множество места, са инжектирани 10 женски и 10 мъжки възрастни (4 mph) зебра на 2 места (вдясно и отляво на гръбната перка), 10 женски и 10 мъжки възрастни (4 mph) зебра инжектирани на 3 места (отдясно и отляво на основата на гръбната перка и гръдната перка), а 10 риби са служили за контрол. Рибите се държат с плътност 10 риби/20 L. Дължината и теглото на рибите се определят в началото и в края на експеримента. Времето за инжектиране се записва и задържането на етикета се определя след 1 месец.

Проба 6: Оцеляване на парцали1 -/- риба зебра

За да се определи преживяемостта на потиснати от имуните rag1 -/- зебра, 30 възрастни (4 mph) rag1 -/- и 30 диви зебра са инжектирани с VIE маркери в основата на гръбната перка. Десет риби/резервоар бяха държани за 1 месец и оценени.

Статистически методи

Групите за третиране за всяко изпитване са описани по-горе и са обобщени в Таблица 1. Броят на резервоарите за третиране и броят на рибите в резервоар са описани по-горе. Данните за смъртност и задържането на етикети на лечения между групи са анализирани чрез анализ на таблицата за извънредни ситуации, използвайки хи-квадрат тест за независимост за сравнение с ниво на значимост при P≤0,05. Данните за растежа бяха анализирани чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с post hoc Tukey анализ за множество сравнения с ниво на значимост при P≤0.05. Фрагментацията на етикета беше анализирана чрез независим пробен Т-тест с ниво на значимост при P≤0.05. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SPSS за Windows 15.0 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс).

Резултати

Проба 1: Местоположение на етикета VIE

В проба 1 бяха оценени зарастването на мястото на инжектиране, лекотата на нанасяне и задържането на еластомера. Таблица 2 предоставя общ преглед на всички тествани местоположения на VIE. Истмусът е трудно място за инжектиране и може да се инжектира само малко количество еластомер. Всички еластомери бяха задържани, но бяха трудни за виждане. Основата на гръдната перка също запазва всички VIE тагове, но е трудно да се инжектира и ако не се направи внимателно, може да нарани рибата фатално. Инжектирането на основата на гръбната перка с еластомер беше лесно, всички етикети бяха задържани и мястото на инжектиране зарасна добре. Следователно основата на гръбната перка е предпочитаното място за маркиране на VIE при рибите зебра. Като цяло най-добрите места за инжектиране са основата на гръбната перка, последвана от основата на гръдната перка. Всички маркери в основата на гръбната и гръдната перка са запазени 4 месеца след първоначалните инжекции.

Опит 2: Цвят и видимост на етикета VIE

Когато се сравняват цветовете на етикетите VIE (в основите на гръбната перка и основите на гръдните перки), всички маркери се запазват и местата за инжектиране се излекуват, когато рибите се оценяват след 20 дни. Жълтите и оранжевите, както и розовите и червените етикети на VIE бяха трудни за разграничаване един от друг, а синьото не се виждаше при околна светлина, но се виждаше, когато беше флуоресцирано от UV светлина. Видимостта на етикетите беше по-добра в основата на гръдната перка, но рибите трябваше да бъдат извадени от водата, за да бъдат изследвани, докато етикетите в основата на гръбната перка бяха видими, без да се изваждат рибите от водата. Класиране на най-слабо видимите цветове беше розово, червено, оранжево, жълто и синьо.

Проба 3: Проучване на растежа

Младите риби зебра са претеглени (средно ± sd) и дължината е измерена (средно ± sd) в началото на експеримента (първоначално) и в края на експеримента (хоризонтално, вертикално, контролно). Нямаше значителна разлика в теглото в края на експериментите от 1 mph, 2 mph и 3 mph (панел А). Нямаше значителна разлика в дължината в края на експеримента от 1 mph, 2 mph и 3 mph (панел B). Скоростта на растеж на младите риби зебра не се влияе от маркирането на гръбната перка. Тест за хи-квадрат P> 0,05 (mph = месеци след излюпване).

В заключение, скоростта на растеж на младите риби зебра не е била повлияна от маркирането на гръбната перка (фиг. 2). Задържането на хоризонтални етикети е по-добро от задържането на вертикални маркери в ранните етапи на растеж на рибата (1–2 mph).

Проба 4: Проучване за дългосрочно задържане

Когато са имплантирани 4-месечни женски данио, средното тегло на рибата е 0,7 ± 0,03 g. След една година средното тегло се увеличи до 1,1 ± 0,12 g; това е сравнима със средното тегло от 1,0 ± 0,16 g при контролна риба. Степента на оцеляване е била 96% при маркираните жени и 94% при немаркираните женски данио. Мъжките риби зебра са тежали 0,45 ± 0,05 g при 4 mph. След една година средното тегло се увеличи до 0,63 ± 0,07 g; това е сравнима със средното тегло от 0,64 ± 0,12 g при контролна риба. Степента на преживяемост на маркираните мъжки рибки зебра е 90% в сравнение с 94% при немаркираните мъжки риби. Всички риби запазват своя VIE етикет по време на проучването. Записано е времето за маркиране и използването на еластомера, за да се сведе до минимум загубата на еластомерен материал. Средно бяха необходими 22 ± 3 секунди, за да се инжектира женска зебра с 5 mm лента VIE еластомер и 29 ± 6 секунди, за да се извърши същата процедура при мъжки зебра. Използвани са общо 0,1 ml VIE еластомер за маркиране на 50 риби с един етикет. В обобщение, маркирането не пречи на дългосрочния растеж и оцеляване. Плодовитостта на рибите не е била засегната от етикетите VIE и средно 120 възрастни риби зебра могат да бъдат инжектирани с един етикет за един час.

Опит 5: Множество сайтове за маркиране

Проба 6: Оцеляване на парцали1 -/- риба зебра

VIE таговете могат безопасно да се използват за маркиране на имунодефицитни rag1 -/- zebrafish; всички лечения за маркиране са имали 100% оцеляване.

Дискусия

Методът VIE се използва успешно с дребни риби като мумикоги (Skinner et al., 2006), дребен костур (Perca fluviatilis) и обикновен побойник (Gobiomorphus cotidianus) (Goldsmith et al., 2003). Сайтове, които се инжектират по-лесно при по-големи риби, са трудни за инжектиране в риби зебра. След инжектирането обаче нашите зебрафи, особено възрастни, са имали висока преживяемост и добри времена на задържане на маркера. Намалено задържане на етикети се наблюдава при млади риби зебра и риби, инжектирани с множество етикети. Прилагането на VIE етикети при видове, които ще останат малки, предлагат по-малко предизвикателства от маркирането на риби, които ще растат значително по време на използването на маркера (Northwest Marine Technology, Inc., 2006, „Маркиране на малки риби с видим имплант еластомер“). При малки тропически риби (-/- риби. Препоръчваме да се определи преживяемостта при мутантни щамове данио преди използването на етикети VIE в експерименти.

Като цяло, нашите резултати показват, че методът за маркиране VIE е подходящ за риби зебра, на възраст от 1 месец. Розовите етикети VIE, инжектирани в основата на гръбната перка, бяха запазени и останаха най-видимите в дългосрочен план. Видимото маркиране на имплантантния еластомер осигурява отлични ресурси за идентифициране на рибки зебра и други малки риби в изследователските съоръжения на вратите.

Благодарности

Авторите биха искали да благодарят на д-р Робърт Уилс за насоки и помощ при статистическа оценка.

Финансиране

Това изследване е финансирано от Колежа по ветеринарна медицина в Държавния университет в Мисисипи.

Бележки под линия

Авторски приноси C.H., L.P.-H. замислил и проектирал експериментите. C.H. извършва експерименти, анализира данните и пише статията. L.P.-H. преработи и редактира статията.

Конкуриращи се интереси Авторите нямат конкурентни интереси, които да декларират.