Тимур Ю. Магарламов

1 Национален научен център по морска биология, Далекоизточен клон, Руска академия на науките, Владивосток 690041, Русия; [email protected] (T.Y.M.); ur.ufvd@id_avokinlem (D.I.M.); [email protected] (A.V.C.)

2 Училище по биомедицина, Далекоизточен федерален университет, Владивосток 690090, Русия

Дария И. Мелникова

1 Национален научен център по морска биология, Далекоизточен клон, Руска академия на науките, Владивосток 690041, Русия; [email protected] (T.Y.M.); ur.ufvd@id_avokinlem (D.I.M.); [email protected] (A.V.C.)

2 Училище по биомедицина, Далекоизточен федерален университет, Владивосток 690090, Русия

Алексей В. Чернишев

1 Национален научен център по морска биология, Далекоизточен клон, Руска академия на науките, Владивосток 690041, Русия; [email protected] (T.Y.M.); ur.ufvd@id_avokinlem (D.I.M.); [email protected] (A.V.C.)

3 Училище по естествени науки, Далекоизточен федерален университет, Владивосток 690090, Русия

Резюме

1. Въведение

Тетродотоксинът (TTX) е непротеинов невротоксин, който блокира натриевите (Na +) канали в нервните и мускулните тъкани. Първоначалният интерес към TTX е резултат от многобройни хранителни отравяния, причинени от консумацията на морски дарове, съдържащи TTX.

През 60-те години TTX придобива широка популярност като инструмент за експериментална невробиология, въпреки че напоследък се появява по-широк интерес към използването на този токсин в терапия за лечение на пристрастяване, епилепсия, като местен и общ анестетик и аналгетик, както и за други медицински цели [1 ]. TTX е открит за пръв път през 1909 г. от Йошидзуми Тахара, който извлича токсина от яйчниците на глобуси (fam. Tetraodontidae), въпреки че токсичността на буферите е известна отдавна [2]. TTX е изолиран за първи път в кристална форма през 50-те години [3] и хроматографски извлечен през 60-те години [4].

По-нататъшни проучвания откриват този невротоксин в различни морски и някои сухоземни животни и в морски водорасли [5,6,7,8]. Широкото разпространение на TTX във филогенетично различни групи еукариотни организми позволява хипотезата за бактериалния произход на токсина. Съгласно тази хипотеза, симбиотичната/асоциативна TTX-продуцираща микрофлора на TTX-носещи организми е първоначалният източник на токсина в гостоприемника. Съществуват обаче някои аргументи срещу приноса на асоциативната микрофлора за интоксикацията на организма домакин. Например, TTX-продуциращи бактерии са открити при повечето, но не при всички видове, носещи TTX (виж по-долу). Освен това нивото на TTX, произведено от бактериални щамове, е много по-ниско от концентрацията на този токсин в гостоприемника. Откриването на TTX-продуциращи бактерии в морски и сладководни утайки позволи хипотезата на TTX биоакумулация чрез малки зоопланктон и хранилки за детрит по хранителната верига [9]. Въпреки многобройните данни за бактерии, произвеждащи TTX, приносът на микроорганизмите за биоакумулирането на TTX в морските екосистеми все още е предмет на дебат.

Неотдавнашен преглед, посветен на морските бактерии, произвеждащи TTX [10], подчертава таксономичното разнообразие и географското разпространение на микрофлората, произвеждаща TTX, свързана с морски организми. Въпреки това, много въпроси, като пътищата за миграция на токсини от бактерии в телата на животните гостоприемници и последващото биоакумулиране на токсини, и приносът на свързаната микрофлора към токсичността на организма, не бяха обсъдени. Разнообразието от методи за откриване на TTX, основани на различни принципи на действие, произтича от сложността на откриването на токсини в биологични проби. Трябва да се има предвид неефективността на някои от методите за откриване на бактериални проби, преди да се направи заключение относно производството на TTX в даден щам.

Този преглед се фокусира върху механизмите за екскреция на TTX на микробни продуценти и миграцията на токсини от бактерии към организми гостоприемници. Обсъжда се и екологията и географското разпространение на морски бактерии, произвеждащи TTX. Специално внимание се обръща на методите за откриване на TTX и надеждността на съответните данни, като се набляга особено на методи, склонни към фалшиво положителни резултати за откриване на токсини.

2. Методи за откриване на TTX

В момента има няколко методологии за откриване на TTX в биологични проби, включително бактерии (Таблица 1). Методите за откриване на TTX са разделени на три различни методологични подхода, базирани на физикохимичните свойства на токсина, неговата антигенна специфичност и невротоксичен ефект.

маса 1

Общи методи за откриване на тетродотоксин (TTX) при бактерии.

ниска точност поради индивидуална изменчивост на биологичните обекти;

малко данни за валидиране;

трудности при закупуване на мишки;

ниска специфичност, позволява да се определи само общата концентрация на токсини, блокиращи Na-канала в пробата

Таблица 2

TTX-продуциращи бактерии, изолирани от водни системи.

Микроорганизъм, произвеждащ TTX Брой щамове Източник на изолация * Място Метод за откриване на TTX Открити токсини Концентрация на TTX (µg/mL) Референции
Vibrio sp.1ксантид раци
Atergatis floridus		ЯпонияHPLC – FLD
GC – MS		TTX
анхидро-TTX		NM[26]
Pseudomonas sp.1червено водорасло
Jania sp.		ЯпонияHPLC – FLD
HPLC – FAB – MS
MBA		TTX
анхидро-TTX		 Таблица 2). Такова географско разпределение на TTX-продуциращите бактерии се дължи до голяма степен на таксономичното разнообразие на животните, с които те се свързват. Поради високата конкуренция сред животните, живеещи в тези региони, някои от тях се фокусират върху симбиоза с бактерии, произвеждащи токсини. Въпреки това, щамове, произвеждащи TTX, са изолирани от няколко немертови вида [43,57] и двучерупчести мекотели [61], живеещи в бореални ширини. През последните години в Средиземно море и Атлантическия океан бяха открити TTX риби-пухери [72,73], коремоноги [74,75,76,77,78] и двучерупчести мекотели [61,62]. Повишаването на глобалните температури в океана и миграцията на видове, живеещи в Червено море през Суецкия канал, се считат за основните причини за появата на TTX животни в европейските води [2]. Трябва обаче да се отбележи, че повишаването или понижаването на температурата може да повлияе на скоростта на растеж, метаболизма и разнообразието от симбиотични микроорганизми. Изследванията на микробния състав на различни органи на риба-бухалка T. niphobles показват, че намаляването на температурата намалява разнообразието и оцеляването на свързаните бактерии [79]. Високи концентрации на TTX, открити в пухените риби Lagocephalus lunaris от януари до март при температура на водата 25–26 ° C, съвпадат с повишеното производство на токсини от симбиотичните бактерии Shewanella putrefaciens през същия период [56]. През останалите месеци, при температура на водата от 29–30 ° C, се наблюдава активен растеж на този щам, но производството на токсини от бактерии и концентрацията на токсини в пухените риби са значително намалени.

4. Таксономично разнообразие на TTX-произвеждащите бактерии

При изследвания върху организми, носещи TTX, както от морски, така и от сладководни утайки, са изолирани TTX-продуциращи представители на 31 рода бактерии (Таблица 2). Повечето изолирани щамове принадлежат към вида Proteobacteria и клас Gammaproteobacteria (родове Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Shewanella, Alteromonas и др.), Но са открити и представители на Alphaproteobacteria (родове Caulobacter и Roseobacter) и Betaproteobacteria (род Alcaligenes) ( Фигура 1 ). Продуциращите TTX бактериални щамове на phyla Firmicutes (родове Bacillus, Lysinibacillus и Enterococcus), Bacteroides (родове Flavobacterium и Tenacibaculum) и Actinobacteria (родове Actinomycetes, Microbacterium, Micrococcus и Nocardiopsis) са по-редки.

разпространение

Таксономичен състав на TTX-продуциращи бактерии. Диаграмата се основава на анализа на 150 TTX-продуциращи щамове, открити до момента.

В литературата има съобщения за най-малко 150 бактерии, продуциращи TTX (Таблица 2). Представители на род Vibrio, открити в много животни, носещи TTX, съставляват повече от 30% от всички щамове, произвеждащи TTX. Повечето изследвания показват връзка между производството на токсини и наличието на V. alginolyticus в микрофлората на водните животни [28,29,35]. Представителите на рода Bacillus включват приблизително 15% от изолираните щамове, продуциращи TTX. Щамовете Pseudomonas, Aeromonas, Alteromonas, Streptomyces и Roseobacter съставляват до 7% от бактериите, произвеждащи TTX. Други родове са представени само от един щам всеки.

За по-голямата част от щамовете, продуциращи TTX, е определено тяхното родово положение; само 25% от изолираните щамове са идентифицирани като определени видове (Таблица 2). Видовата специфичност на бактериалния синтез на TTX в момента остава отворен въпрос. Както Matsumura [23] и Strand et al. [25] демонстрират, че проучванията върху V. alginolyticus показват, че не всички щамове от този вид са способни да произвеждат TTX. Подобни проучвания върху други видове, включително някои производители на TTX, все още не са провеждани; следователно не можем да изключим възможността само определени щамове да имат способността да синтезират токсина.

5. Бактерии, произвеждащи TTX, като обещаващ източник на токсин за фармацевтичната индустрия

Благодарение на уникалната си структура, TTX и неговите аналози блокират междумембранните течения в възбудимите тъкани (мускулни и нервни), без да нарушават хомеостазата на околните тъкани. Това токсично свойство е широко използвано в невробиологията [80,81]. Силният аналгетичен ефект на TTX определя успешното му приложение в медицинската практика. Лекарствата, базирани на TTX, са тествани в клинични изпитвания и могат да се използват като общи и местни аналгетици [82], както и за локална анестезия [83]. Токсинът представлява фармацевтичен интерес като невропротективен агент при исхемична мозъчна травма, причинена от инсулт, и като ренопротективен и антиноцицептивен агент [59].

Понастоящем единственият метод за производство на TTX се основава на извличане на токсини от токсични органи на рибата-пуфър. Този метод има ниска ефективност и има отрицателно въздействие върху водната екосистема, подкопавайки популациите на TTX-съдържащи риби от семейство Tetraodontidae [84]. Известни са и успешни опити за химичен синтез на този токсин, но те доведоха до нисък добив на краен продукт [85]. Използването на бактериални производители в производството на лекарства е по-изгодно и е причина за голям интерес към морските бактерии като източник на TTX.

Накратко, липсата на оптимални условия за култивиране на бактерии и синтез на TTX и бърза загуба на способността да се произвежда токсинът, предотвратява използването на бактерии в индустриалното производство на токсини за фармацевтично производство и усложнява търсенето на нови щамове, произвеждащи TTX.

6. Дискусия

След откриването на първите бактериални продуценти на TTX от Noguchi et al. [26] са открити повече от 150 TTX-продуциращи щамове от различни таксономични групи (Протеобактерии; Firmicutes; Актинобактерии; Bacteroidetes) (Фигура 1). Продуциращите токсин щамове са предимно изолирани от морската среда, включително асоциативна/симбиотична микрофлора на TTX-носещи организми и морски утайки (Таблица 2). Ако фактът на производството на токсини от морски бактерии не се обсъжда, миграцията на TTX в морската среда поражда много въпроси.

Предполага се, че механизмът на екстракция на TTX от продуциращи токсин бактерии в околната среда се осъществява чрез: (1) клетъчна смърт; (2) пасивно/активно отделяне на токсин от клетките; (3) поникване на спори на спорообразуващи бактерии (Фигура 2). В момента процесът на бактериална екскреция на TTX в околната среда е предложен само за представители на рода Bacillus [57]. Откриване на TTX в клетъчната стена и ядра на фосфорите и свободните спори на Bacillus sp. 1839 г. доведе до предположението, че свободните и зрели спори, освободени от спорангия на спорообразуващи бактерии, водят до освобождаване на токсини в околната среда. Няколко проучвания показват появата на TTX както в културен бульон, така и в клетки по време на култивирането на щамове Vibrio в течна среда [28,35,48]. Разкриването на токсинната функция при бактериите ще помогне да се отговори на въпроса дали миграцията на TTX в бактериалните клетки е насочена или има спонтанен характер.

Предложени механизми за миграция на TTX от бактерии, произвеждащи токсини, към околната среда.

Уилямс [70] предположи, че широкото разпространение на TTX сред микроорганизмите показва важна роля на токсина за бактериите, но тази роля е неизвестна. Съществуването на свободно живеещи бактерии, продуциращи TTX, опровергава основната хипотеза за TTX като вторичен метаболит, секретиран за целите на гостоприемника [1]. Търсенето на молекулярни цели на дадено вещество е един от методите за тяхното функционално разпределение. Натриевите канали на възбудимите тъкани на животното е единственият известен целеви клас TTX [88]. По този начин, TTX в бактериална клетка може да бъде регулатор на йонния поток, задвижван през натриеви натриеви канали. За да се провери това твърдение, трябва да се изследва TTX чувствителността на зависимите от напрежението натриеви канали на бактериите, произвеждащи токсини. Понастоящем е проверена TTX чувствителността само за два бактериални натриево зависими натриеви канала от 500 известни хомолога [89]. И двата канала са изолирани от нетоксична алкалофилна бактерия Bacillus halodurans и са имали висока устойчивост към токсина [90].

7. Заключения и бъдеща перспектива

Досега въпросите за биологичното разнообразие на микробните производители на TTX и тяхното участие в токсификацията на животни бяха по-добре адресирани от въпросите за биосинтеза на TTX и ролята на токсина в бактериалните клетки. Първоначалните опити за декодиране на генетичната основа на биосинтеза на TTX при бактериални продуценти са предприети наскоро. Liu et al. [87] са показали положителна корелация между копията на pNE-1 плазмид и концентрацията на TTX в щама Aeromonas sp. Ne-1. Друго проучване разкрива наличието на не-рибозомен пептид-трансфераза, за който се предполага, че участва в синтеза на гуанидинова група на TTX в бактериални щамове, продуциращи TTX [22]. Декодирането на биосинтетичните пътища и функции на TTX в бактериалните клетки е от решаващо значение за изследване на по-нататъшните природни източници на TTX. Очевидно е, че много микроорганизми имат способността да произвеждат TTX, но неговият синтез зависи от неизвестни условия; тоест токсинът няма да бъде постоянно откриван в бактериалната култура. Отсъствието на TTX-положителни бактерии при някои животни, носещи TTX [108], може да се обясни с незадължителността на синтеза на TTX, въпреки че евентуалното съществуване на некултивирани TTX-продуциращи бактериални щамове също трябва да се вземе предвид.

Благодарности

Настоящата работа беше финансово подкрепена от Руската научна фондация (проект № 15-15-20026).