Резюме

Заден план

Добре известно е, че храненето с диета с висок концентрат (HC) на лактиращи преживни животни вероятно предизвиква подостра руминална ацидоза (SARA) и води до намаляване на производството на млечни мазнини. Въпреки това, ефектите от храненето с HC диета за дълги периоди върху състава на млечните мастни киселини и механизма на спада на млечните мазнини все още остават недостатъчно разбрани. Целта на това проучване е да се изследва въздействието на храненето на HC диета с лактиращи млечни кози върху добива на млечни мазнини и състава на мастните киселини с акцент върху механизмите, лежащи в основата на депресията на млечните мазнини. Седемнадесет млечни кози в средата на кърмене бяха разпределени на случаен принцип в три групи. Контролното лечение е хранено с нискоконцентрирана диета (35% концентрат, н = 5, LC) и имаше две висококонцентрирани лечения (65% концентрат, HC), едното хранено с диета с висок концентрат за дълъг период (19 седмици, н = 7, HL); човек е хранел диета с висок концентрат за кратък период от време (4 седмици, н = 5, HS). Измерва се производството на млечна мазнина и профилите на мастни киселини. За да се изследват механизмите, лежащи в основата на промените в производството и състава на млечната мазнина, също се анализира генната експресия, участваща в липидния метаболизъм и метилирането на ДНК в млечната жлеза.

Резултати

Производството на мляко се увеличава чрез хранене на HC диетата в групите HS и HL в сравнение с LC диетата (P

Заден план

Млякото съдържа високи нива на хранителни вещества като протеини, мастни киселини, фосфолипиди, витамини и минерали [1]. Сред тези хранителни вещества млечната мазнина играе важна роля за определяне на качеството и енергийния състав на млечните продукти [2]. Млечната мазнина съдържа голямо количество наситени мастни киселини (SFA) и ненаситени мастни киселини (UFA). Наскоро доказателствата показват, че високите нива на SFAs представляват потенциален риск за човешкото здраве, като сърдечно-съдови заболявания (ССЗ) [3]. За разлика от това, има епидемиологични доказателства, които показват, че мононенаситените мастни киселини в диетата (MUFA) и полиненаситените мастни киселини (PUFA) имат благоприятни ефекти за предотвратяване на ССЗ, като благоприятно влияят върху редица рискови фактори за ССЗ, включително плазмени липиди и липопротеини. Например, олеиновата киселина има защитен ефект срещу ретинопатия [4]. По същия начин ейко-сапентаеновата киселина (EPA) и докозахексаеновата киселина (DHA) играят полезни роли за предотвратяване на диабет, атеросклероза и артрит [5]. Изследвани са много стратегии за повишаване на съдържанието на ненаситени мастни киселини в млякото [6,7,8].

Повечето млечни животни в интензивни производствени системи се хранят с високи нива на зърно, за да увеличат максимално енергийния прием и производството на мляко. Въпреки това, прекомерните количества неструктурни въглехидрати и силно ферментиращ фураж ще доведат до бърза ферментация и натрупване на органични киселини в търбуха [19], което вероятно предизвиква подостра руминална ацидоза (SARA) [19, 20]. Както острата, така и подострата руминална ацидоза могат да намалят производството на млечна мазнина и да причинят депресия на млечната мазнина и изместване на профилите на мастните киселини при лактиращите крави [20]. Доколкото ни е известно, ефектите от дългосрочното (повече от 4 месеца) хранене с диета с висок концентрат (HC) на лактиращи преживни животни върху производството и състава на млечната мазнина и съответните механизми, свързани с промените в млечната мазнина, все още са неизвестни. В това проучване средно кърмещите млечни кози са хранени с HC диета за дълъг (19 седмици) или кратък (4 седмици) период. Измерват се профилите на млечна мазнина и FAs и се оценява съответната генна експресия и метилиране на ДНК в млечната жлеза, за да се изследват механизмите, залегнали в основата на промените в производството и състава на млечната мазнина.

Методи

Животни и експериментални процедури

Избрани са седемнадесет здрави кози със средно кърмене (млечни кози Guanzhong, 60 ± 5 d лактация) със средно първоначално телесно тегло 49,7 ± 5,5 kg (средно ± SD) и подобна дневна млечност (1,18 ± 0,13 kg/d) и се помещават индивидуално (квадратна мярка: 3.0

3,2 м 2) в стандартна къща за хранене на животни в Северозападния университет A и F (Шанси, Китай). Преди експеримента на всички кози беше разрешен свободен достъп до контролна диета, съдържаща съотношение фураж и концентрат 65:35 за 2 седмици. Съставките и химичният състав на експерименталните диети са показани в Допълнителен файл 1: Таблица S1. След диетична адаптация козите са разпределени на случаен принцип в три групи и дневният млечен добив във всяка група преди началото на експеримента не показва значителна разлика, както е показано на фиг. 1 (P > 0,05). Контролното лечение е хранено с нискоконцентрирана диета (35% концентрат, н = 5, LC), докато имаше две обработки с висок концентрат (65% концентрат, HC), едната хранеше диета с висок концентрат за дълъг период (19 седмици, н = 7, HL), а другият хранеше диета с висок концентрат за кратък период от време (4 седмици, н = 5, HS) след 15 седмици диета с нисък концентрат. Всички кози са били хранени ежедневно съответно в 08:00 и 18:00 и са доени два пъти дневно преди хранене.

високозърнести

Измененията в млечността, млечните мазнини и протеините. а Дневен добив на мляко (kg/d); б Съдържание на млечна мазнина (%); ° С Съдържание на млечен протеин (%). Звездичката * показва значителна разлика между контролната група HL и LC

Вземане на проби и анализ

В края на експеримента козите бяха евтаназирани след нощно гладуване. Всички кози бяха убити с инжекции на ксилазин от вени във врата [0,5 mg/kg телесно тегло; Ксилозол; Ogris Pharme, Wels, Австрия] и пентобарбитал [50 mg/kg телесно тегло; Освобождаване; WDT, Гарбсен, Германия]. След евтаназия, част от тъканите на млечните жлези бяха събрани и незабавно замразени в течен азот и след това използвани за обща екстракция на РНК, геномна ДНК и протеин.

Анализ на млечните мастни киселини

Проби от мляко се събират два пъти дневно преди хранене, съответно в 08:00 и 18:00. Пробите от мляко се смесват старателно и една порция се съхранява при 4 ° C за анализ на млечните мазнини и протеини, друга се съхранява при -70 ° C за анализ на състава на мастните киселини. Нивото на млечните мастни киселини беше открито в съответствие със стандартния протокол за газова хроматография в Академията за селскостопански науки в Дзянсу, както беше описано по-рано [21].

Екстракция на РНК и количествена PCR в реално време

Уестърн блотинг анализ

Анализ на ДНК метилиране

Геномната ДНК беше извлечена от тъканите на млечните жлези с помощта на търговски комплект (DP304, TIANGEN Biotech Co., LTD. Пекин, Китай). Накратко, 100 mg прах от млечна жлеза се инкубира с 1 ml лизисен буфер (pH 8,0, 50 mmol/L Tris; 100 mmol/L EDTA; 100 mmol/L NaCl; 1,0% SDS), съдържащ фенол, хлороформ и 50 μL протеиназа К (10 mg/ml запас) при 55 ° С в продължение на 2 часа и след това се центрофугира при 12 000 × g за 5 минути. Събират се около 500 μL супернатант и се инкубират с 500 μL изопропилов алкохол и 60 μL 3,0 mol/L натриев ацетат (рН 5,2) при стайна температура в продължение на 5 минути и след това се центрофугират при 12 000 об/мин за 15 минути. Гранулата се измива два пъти със 70% етанол, след изсушаване гранулата накрая се ресуспендира в ТЕ буфер (рН 8,0, 10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA). Пробите се инкубират при 65 ° С на разклащаща се водна баня за 1 h, за да се осигури добра ресуспендиране.

Изолираната геномна ДНК се обработва с ултразвук, за да се получат произволни фрагменти с размер от 300 до 500 bp. Условието за обработка с ултразвук е настроено със следните параметри: изходна мощност 30 W, 5 s пулс включен и 5 s импулс изключен, 10 цикъла. Два микрограма обработена с ултразвук геномна ДНК се денатурира топлинно, за да се получи едноверижна ДНК и същата част от неденатурираната ДНК се съхранява като контролна (входна) ДНК. Метилираните фрагменти на ДНК се утаяват с имунни моноклонални антитела срещу 5-метил цитидин (ab10805, Abcam). Предварително изчистеният протеин A/G Plus агароза (Santa Cruz, Dallas, TX) се използва за имунно утаяване на антитяло/ДНК комплексите и MeDIP DNA се пречиства. Четиридесет нанограма на MeDIP ДНК и контролна входна ДНК бяха използвани за усилване на ACACA, SCD, FAS, ACSL1, ACSS1 & 2, FADS2 промоторни региони чрез PCR в реално време със специфични праймери (Таблица 2). Праймерите са проектирани със софтуера на „Methyl Primer Express“, като се използва специфичната промоторна последователност, обогатена с CpG сайтове, взривени от уебсайта на „http://www.ensembl.org/index.html“. Съотношенията на сигналите в имунопреципитираната ДНК спрямо входната ДНК бяха изчислени като мярка за представяне на относителното обогатяване на метилирането в конкретната проба.

FAS анализ на ензимната активност

Ензимната активност на FAS в тъканите на млечните жлези е измерена чрез FAS Kit за анализ на активността (Институт по биоинженеринг Джианчен, Нанкин, Китай).

Статистически анализ

Всички данни са представени като средната стойност ± SEM. Данните за млечността и състава на млякото бяха анализирани за различия, дължащи се на диетично лечение, времеви ефект и тяхното взаимодействие, като се използва PROC MIXED, SAS 9.3, (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Данните за млечния добив, млечната мазнина и протеините, получени преди началото на лечението, се разглеждат като ко-променлива в статистическия анализ. Разликите в параметрите в състава на мастните киселини, експресията на гени и протеини, ензимната активност в млечната жлеза бяха анализирани с помощта на post hoc анализ с тест за най-малко значима разлика след ANOVA на SPSS 11.0. Методът 2 -ΔΔCt се прилага за анализ на PCR данните в реално време. Разликите бяха счетени за значителни при P

Резултати

Млечен добив и производство на млечни протеини и мазнини

Както е показано на фиг. 1а-в, козите, хранени с диета с висок концентрат (HL и HS група), произвеждат (P 0,05). Съдържанието на наситени мастни киселини (SFA) в млякото показва тенденция към нарастване в HL групата в сравнение с LC групата (0,05 Таблица 3 Състав на мастните киселини в млечната мазнина

Експресия на ген, участваща в производството на млечна мазнина

Както е показано на фиг. 2, хранене с HC диета на лактиращи млечни кози, регулирана надолу генна експресия, участваща в производството на млечна мазнина в млечната жлеза. По отношение на процеса на транспорт на мастните киселини, иРНК експресиите на LPL, ACSL1, ACSS1 и ACSS2 гените са били по-ниски в млечната жлеза на HL козите (P 0,05).

Експресия на протеин и FAS ензимна активност

Нивата на експресията на протеини ACSL1 и SCD в млечната жлеза се определят чрез Western blot. Резултатите показаха, че нивото на експресия на протеин ACSL1 в млечната жлеза е намалено чрез хранене с HC диета (P 0,05). Активността на FAS ензима също е намалена при HL козите в сравнение с LC групата (P 0,05) (Фиг. 3).

ДНК метилиране анализ

Поради намаляване на генната експресия, свързана с производството на млечна мазнина в млечната жлеза, нивото на метилиране на ДНК в промоторните области на кодиращите гени беше измерено с помощта на метода MeDIP. Резултатите показаха, че метилирането на ДНК в промоторните области на SCD и ACACA гените е по-голям в млечната жлеза на HL козите в сравнение с LC групата (P 0,05) (Фиг. 4).

Дискусия

За да отговорят на енергийното търсене при високо производство на мляко, млечните животни обикновено се хранят с HC диета, която вероятно причинява анормална ферментация в червея и води до метаболитни нарушения, известни като SARA. Предишни проучвания показват, че 19% от ранните лактации и 26% от кравите в средата на лактацията са имали SARA [23]. Кърмещите животни, страдащи от SARA, имат повишен риск от диария, ламинит и възпалителни реакции [24, 25]. Тази широко използвана стратегия за хранене в крайна сметка води до намаляване на качеството на млякото с по-малко количество млечна мазнина [25,26,27]. В това проучване, както се установява на практика, нашите резултати показват, че производството на мляко е значително увеличено чрез хранене с HC диета както в HL, така и в HS групите в сравнение с LC групата, докато процентът на млечните мазнини е значително по-нисък в HL групата. Предишно проучване също демонстрира, че храненето с високо зърнени храни на лактиращи млечни крави води до депресия на млечната мазнина с по-ниски концентрации на млечни мазнини [28].

Заключения

Краткосрочното хранене с HC диета има незначителни ефекти върху производството и състава на млечните мазнини при лактиращи млечни кози. Въпреки това, дългосрочното хранене с HC диета ще предизвика депресия на млечната мазнина и промяна на профила на FAs с по-ниски MUFA, но по-високи SFA. Намаляването на регулацията на генната експресия, участваща в процеса на производство на липиди, и регулирането на метилирането на ДНК в млечната жлеза може да допринесе за намаляване на производството на млечна мазнина при HL кози.