Резюме

Въведение

Перфлуороктансулфоновата киселина (PFOS) принадлежи към клас химикали, известни като перфлуороалкилови киселини. Тези хидрофобни и липофобни съединения се използват в различни битови и промишлени приложения поради техните термични и химически стабилни свойства [1]. PFOS присъства в 99,9% от пробите от човешки серум в САЩ със средна геометрична серумна концентрация от 20,7 μg/L [2]. PFOS може да бъде намерен в хората и дивата природа по целия свят [3] PFOS се подлага на биоакумулация при хора поради дългия серумен полуживот от 4,7 години [4]. PFOS се разпространява предимно в черния дроб на възрастни гризачи и фетуси, изложени вътреутробно [5], където индуцира чернодробна стеатоза, хепатомегалия и чернодробна канцерогенеза [6–8].

парадоксален

Понастоящем безалкохолното чернодробно заболяване (NAFLD) е основното чернодробно разстройство с над 25% разпространение сред общата популация и е в световен мащаб, включително в САЩ [9]. Пациентите с NAFLD са изложени на по-висок риск от прогресиране до по-тежки форми на чернодробно заболяване като NASH, фиброза, цироза, което в крайна сметка води до HCC, който е втората най-честа причина за смъртни случаи, свързани с рак [10, 11]. NAFLD е основната чернодробна проява на метаболитен синдром, който е съвкупност от симптоми, включително затлъстяване, захарен диабет и дислипидемия [12]. Напоследък асоциираната с токсични вещества мастна чернодробна болест (TAFLD) се определя като мастна чернодробна болест, свързана с химическо въздействие [13]. Вероятно е, че PFOS е причинител на TAFLD, като се има предвид способността му да индуцира чернодробна стеатоза и повсеместно присъствие в проби от човешки серум с потенциал за биоакумулиране.

В това проучване използвахме експериментален модел на NAFLD, индуциран от диетично хранене с високо съдържание на мазнини, за да тестваме способността на експозициите на PFOS, съответстващи на човека, да влошат образуването на мастни чернодробни заболявания. Противно на нашата хипотеза, ние наблюдавахме защитен ефект срещу HFD-индуцирана NAFLD, когато PFOS се прилага едновременно с HFD. Изследвахме експресията на метаболитни гени и регулатори, за да изследваме потенциалните механизми на защита. Нашите открития разкриват зависимата от диетата токсичност на PFOS и предоставят доказателства за неговите хорметични ефекти върху развитието на чернодробна стеатоза.

Материали и методи

Грижа за животните и подготовка на тъкани

Всички проучвания върху животни бяха одобрени и проведени в съответствие с Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) към Медицинския център на Университета в Канзас. Осемседмични мъжки мишки C57BL/6J, закупени от Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), получиха либитум достъп до нормална диета с чау (ND) (73% kcal въглехидрати, 11% kcal мазнини, 16% kcal протеин) (Custom Animal Diets, AD2001)) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (24.8% kcal въглехидрати, 59.2% kcal мазнини, 15% kcal протеин) (Custom Animal Diets, AD2002) with and without 0.0001% (1 mg/kg) перфлуороктансулфонова киселина (PFOS) (Sigma Aldrich, Сейнт Луис, Мисури) в продължение на шест седмици. Мишките от всяка третираща кохорта (n = 5) бяха настанени в групови условия при контролирани температури (23 ° С) с 10-часов тъмен/14-часов светлинен цикъл. Стратегията за дозиране е избрана чрез екстраполиране на дозата, използвана в предишен доклад, когато мишките се хранят с диета, съдържаща 0,001% PFOS, което води до серумни концентрации на PFOS от 102 μM [14]. Освен това серумна концентрация на PFOS от 11 μg/ml (

23 μM) е постигнато чрез хранене на 0,0001% PFOS, съдържаща диета в продължение на 28 дни [15]. По този начин се очаква дозата, използвана в това проучване, да достигне серумни концентрации близо 10 μM, което по-рано публикуван преглед на литературата предполага, че е сравним с професионалните нива на експозиция [16]. За да се приготви диетата, използвана в това проучване, PFOS се разтваря във вода и се смесва старателно в предварително претеглени прахообразни ND или HFD до крайна концентрация от 1 mg/kg (0,0001%). Диетите се оставят да изсъхнат за една нощ, а гранулите се образуват на следващия ден. Необработените прахообразни диети също се смесват с вода и се оформят в гранули, за да се осигури последователност на хранене. Чернодробната и мастната тъкан се събират, претеглят и замразяват в течен азот по време на евтаназия. Кръвната глюкоза се измерва с глюкомер, като се използва кръв, събрана чрез ретроорбитален синус по време на евтаназия.

Хистология и имунохистохимия

Парафиновите срезове от черен дроб на мишка се оцветяват за хематоксилин и еозин (H&E) и се наблюдават под светлинен микроскоп. Парафиновите срезове от черен дроб на мишка бяха оцветени за пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA), както беше описано по-рано [17]. Пресни замразени чернодробни секции бяха използвани за определяне на чернодробното съдържание на липиди чрез оцветяване с Маслено червено О, както беше описано по-рано [18].

Изолация на протеини и анализ на Western Blot

Изолирането на протеини и анализът на Western blot беше извършен, както беше описано по-горе [16]. Първично антитяло, използвано за откриване на пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA), е закупено от Cell Signaling Technology (Cat. # 2586, Danvers, MA).

Изолация и количествено определяне на чернодробните триглицериди

Общи чернодробни триглицериди (TG) са изолирани от замразен черен дроб, използвайки протокол за смилане на КОН, както е описано по-горе [19]. Количественото определяне на изолираните TG се извършва с помощта на набор от реактиви на триглицериди (GPO) (Pointe Scientific, Каталожен номер T7532-500) и се изчислява чрез сравнение със стандартна крива на известни концентрации на TG, като се използва стандартният реактив на триглицеридите (Pointe Scientific, Каталог # T7531-STD ) съгласно протокола на производителя. Съдържанието на TG, измерено във всяка проба, се нормализира спрямо теглото на черния дроб, използвано за изолиране на TG.

Количествено определяне на серумните липиди

Серумът се приготвя от центрофугиране на прясна кръв при 5000 об/мин за 10 минути. Серумният триглицерид се измерва, като се използва триглицериден (GPO) комплект реактиви (Pointe Scientific, Каталог # T7532-500) и се изчислява чрез сравнение със стандартна крива на известни концентрации на TG, като се използва стандартният реагент Triglcyeride (Pointe Scientific, Каталог # T7531-STD) съгласно към протокола на производителя. Концентрацията на серумен холестерол беше измерена с помощта на набор от холестеролни реактиви (Pointe Scientific, Каталог # C7510) и изчислена чрез сравнение със стандартна крива на известна концентрация на холестерол, използвайки стандартния Reagenet на холестерола (Pointe Scientific, Каталог # C7509-STD) съгласно протокола на производителя.

PCR в реално време

Изолирането на РНК, превръщането в cDNA и анализ на PCR в реално време (RT-PCR) се извършва, както е описано по-рано, без модификация [20]. Промяна в експресията на сгъване в сравнение с контролната диета, хранена, нетретирана група се определя чрез метода ddCt [21] с 18s, използвани като контролен ген за домакинство. Последователностите на праймера за гени от интерес са дадени в Таблица 1 .

маса 1

Последователности на грундове, използвани в това изследване

GeneForward Primer (5′ – 3 ′) Reverse Primer (5′ – 3 ′)
апоалTGTGTCCCAGTTTGAATCCTCGTTATCCCAGAAGTCCCGAG
апоа2GACACCCCTTGTCAGGTCAGTGGCACATCTCACTTAGCCG
апобCTGCAACCAAGCTGGCATAAGCCTCCATCCTGAGTTGGACA
mttpCAAGCTCACGTACTCCACTGAAGTCATCATCACCATCAGGATTCCT
cd36ATGGGCTGTGATCGGAACTGGTCTTCCCAATAAGCATGTCTCC
чукTGCGGATCATGACTCGGATGAGGCCCAGTTGTTGACCAAA
g6pcCCGGTGTTTGAACGTCATCTCAATGCCTGACAAGACTCCA
ppargCCACAGTTGATTTCTCCAGCATTTCCAGGTTCTACTTTGATCGCACTTTG
ппараACAAGGCCTCAGGGTACCAGCCGAAAGAAGCCCTTACAG
srebf1GGGCAAGTACACAGGAGGACAGATCTCTGCCAGTGTTGCC
ces3TGTATGAGTTTGAGTATCGCCCCATCTTGCTGAGGTTGGTCT

Статистически анализ

Всички стълбовидни графики изобразяват средната стойност ± SEM. Извършен е тест на Шапиро-Уилк, за да се провери за нормалност на разпределението, а тестът на Левен се използва за проверка за хомогенност на дисперсията. Всички данни отговарят на тези изисквания. Извършени са множество сравнения, като се използва еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post-hoc анализ на Дънкан с p Фиг. 1А). Въз основа на данните за телесното тегло и консумацията на храна изчислихме, че мишките, хранени с ND + PFOS, получават доза от 0,089 mg/kg/ден, а мишките, хранени с HFD + PFOS, получават доза от 0,087 mg/kg/ден. Няма статистическа разлика в получената доза между тези групи (Таблица 2). Фигура 1В подробно описва разликите в телесната маса, които са се развили между групите по време на проучването. Не съществуват значителни разлики в телесната маса между групите на ден 0. На ден 4, групите, хранени с HFD, са значително по-тежки от ND + NT мишки, но не по-тежки от ND + PFOS мишки. На 18 и 35 ден, групите, хранени с HFD, са значително по-тежки от групите, хранени с ND. Към 42-ия ден, докато мишките с HFD + NT са били значително по-тежки от групите, хранени с ND, лечението с PFOS увеличава теглото при мишки, хранени с ND, и намалява теглото при мишки, хранени с HFD, което не води до значителна разлика между мишки, третирани с ND + PFOS и HFD + PFOS. За да определим причината за разликите в телесното тегло, определихме затлъстяването чрез претегляне на епидидимални мастни накладки (фиг. 1С). Мишките, хранени с HFD, показват значително увеличение на епидидималната мастна маса, както се очаква. Въпреки това, докато лечението с PFOS увеличава епидидималната мастна маса при мишки, хранени с ND, лечението с PFOS не засилва натрупването на маса на епидидима при мишки, хранени с HFD.