Резюме

Затлъстяването е хронично патологично състояние и рисков фактор за диабет тип 2 и сърдечно-съдови заболявания (1–4). Няколко проучвания показват, че по-специално висцералното затлъстяване е силно свързано с инсулинова резистентност, хипергликемия, дислипидемия и хипертония. Подкожно отлагане на мазнини също е свързано с намален риск от сърдечно-съдови заболявания в някои проучвания (5-9). В светлината на различните патологични последици от разликите в разпределението на мастната тъкан е от голям интерес да се разрешат молекулярните разлики между висцералните и подкожните депа на мастната тъкан. Въпреки че анатомичното местоположение и васкуларизацията са ясно различни (10), молекулярната основа на разликите в метаболизма и секреторния профил между висцералните (оменталните) и подкожните мастни тъкани и тяхното въздействие върху физиологията на цялото тяло все още не са напълно разбрани.

плазмените

Оментинът е новоидентифициран секреторен протеин, който се експресира силно и селективно във висцералната мастна тъкан спрямо подкожната мастна тъкан (11–13). Omentin е идентифициран в други тъкани при по-ниски нива на експресия и е наречен интелектин (14), чревен лактоферинов рецептор (15) или ендотелен лектин (16). Той се изразява в чревни клетки на Paneth (17), ендотелни клетки (16) и висцерални мастни клетки от стромално-съдови клетки (11). Проучванията in vitro показват, че оментинът увеличава трансдукцията на инсулинов сигнал чрез активиране на протеин киназата Akt/протеин киназа В и засилване на стимулирания от инсулин транспорт на глюкоза в изолирани човешки адипоцити. По този начин оментинът може да играе паракринна или ендокринна роля в модулирането на инсулиновата чувствителност.

Идентифициран е хомолог на оментина, който споделя 83% аминокиселинна идентичност с оментин/интелектин (16) и ще бъде посочен като оментин 2. Двата гена на оментин, оментин 1 и оментин 2, са локализирани един до друг в 1q22 -q23 хромозомна област (18), която преди това е била свързана с диабет тип 2 в няколко популации (19–23).

Въз основа на преференциалната експресия на оментин 1 във висцералната мастна тъкан, наличието на оментин в кръвообращението и потенциалната му роля като инсулинов сенсибилизатор, ние оценихме връзката на нивата на оментин с мерки за затлъстяване, инсулинова резистентност и свързани характеристики. Разработихме и утвърдихме количествен анализ на Western blotting, който ни позволи да измерим нивата на оментин в плазмата. Открихме, че оментин 1 е основната циркулираща форма на оментин и че плазмените му нива и експресията на гена на мастната тъкан намаляват със затлъстяването. В допълнение, плазменият оментин 1 има положителна корелация с плазмените адипонектин и HDL и отрицателно корелира с оценката на модела на хомеостазата (HOMA), мярка за инсулинова резистентност.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Тези проучвания включват здрави доброволци. Субектите, които са имали злокачествено заболяване, диабет или голяма бъбречна, чернодробна и/или тиреоидна дисфункция, са изключени. Никой не е бил на хормонална заместителна терапия. Протоколите за изследване са одобрени от Институционалните съвети за преглед на изследванията на човешките субекти в Университета в Мериленд и Университета Джон Хопкинс. Получено е информирано съгласие от всички субекти.

Ефект на затлъстяването върху експресията на гена на оментин.

Човешки висцерални (оментални) мастни тъкани са получени от 20 субекта (2 мъже и 18 жени) на различни възрасти (24–73 години) и ИТМ (21,5–66,6 kg/m 2), подложени на интраабдоминална хирургия в Университета на Медицински център Мериленд или Медицински център Джонс Хопкинс Бейвю. След изрязване тъканите незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ° C за последваща екстракция на РНК и количествен RT-PCR анализ. В подгрупа от тези субекти (n = 14, 2 мъже и 12 жени) на възраст (24–50 години) и ИТМ (38,1–66,6 kg/m 2), кръвни проби бяха събрани след нощно гладуване при посещение преди деня на операцията. Плазмата се отделя и съхранява при -80 ° C за последващо количествено определяне на нивата на оментина.

Ефект на затлъстяването върху нивата на човешкия плазмен оментин.

Подгрупа от 94 здрави субекта (54 жени и 40 мъже) от описаното по-рано проучване за диабет на семейството на Амиш (AFDS) (24) бяха избрани като 47 двойки, които най-добре отговарят на критерия за съвпадение на възрастта (в рамките на 5 години) и пол ИТМ несъответствие (> 3,0 kg/m 2 разлика). Дизайнът на BMI-несъответстващ sibpair е избран, за да се увеличи максимално силата за откриване на асоциация с BMI. Един субект не попада в границите на откриване на анализа и двама субекти се считат за извънредни (> 3 SD от средната стойност). Следователно тези три субекта бяха елиминирани от всички анализи. Следователно, 44 двойки бяха използвани в анализа на sibpairs. За допълнителни анализи участниците (n = 91, 52 жени и 39 мъже) бяха разделени на три групи: 1) слаби (n = 39; ИТМ 2), 2) наднормено тегло (n = 30; 25 kg/m 2 ≤ BMI 2) и 3) със затлъстяване (n = 22; ИТМ ≥30,0 kg/m 2).

Идентифициране на оментин 1 и оментин 2 в човешката плазма чрез двумерна гел електрофореза.

Количествено определяне на нивата на оментин в човешката плазма.

Количествено определяне на нивата на адипонектин в човешката плазма.

Общите нива на адипонектин се определят в плазмени проби на гладно чрез търговски комплект за радиоимуноанализ (Linco Research, St. Louis, MO). Пробите се анализират в два екземпляра и се измерват на автоматичен брояч за автоматична гама Packard Cobra-II (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Дублираните измервания с брой, различаващ се с> 10%, бяха отхвърлени и пробите бяха повторно тествани.

Количествен PCR анализ в реално време.

Нивата на оментин 1 и оментин 2 тРНК бяха измерени чрез количествена RT-PCR в реално време в LightCycler 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Общата РНК беше извлечена от проби на мастната тъкан на маточната тъкан с Trizol (Invitrogen). Общата РНК се транскрибира обратно, като се използва cDNA комплект Roche Transcriptor. cDNA (50 ng) беше количествено определена с помощта на LightCycler 480 Probes Master kit (Roche Applied Science) и комплекти сонда/праймер Taqman (omentin 1, Hs00214137_m1; omentin 2, Hs00365614_m1; Applied Biosystems, Foster City, CA). 18S mRNA (18S RNA, Hs999999_sl) беше използвана като вътрешен контрол за нормализиране. Всяка проба се изпълнява в два екземпляра. Повторени са дубликати, показващи SD с> 0,25 праг на цикъла. Номерата на копията на специфичните иРНК бяха получени с помощта на стандартни криви, генерирани с оментин 1-съдържащ (11) и оментин 2-съдържащ (pcDNA3) плазмиди. Нормализирани стойности на генната експресия са получени с помощта на софтуера за относително количествено определяне LightCycler (LightCycler 480; Roche Applied Science).

Статистически анализ.

За да се коригира за структурата на семейството, анализът на компонентите на дисперсията, както е приложен в SOLAR (Sequential Oligogenic Linkage Analysis Rutines), който позволява включването на матрица на родство, за да позволи остатъчни вътрешно-двойни корелации между роднини, е използван за всички анализи, включващи асоциацията на циркулиращите нива на оментин с други черти, свързани със затлъстяването и метаболитния синдром при субекти от амишки (25). Преди анализ данните бяха тествани за нормалност на разпределението чрез теста на Шапиро-Уилк. Следователно, нивата на HOMA, лептин, инсулин и триглицериди бяха естествено трансформирани в log, за да се получи нормално разпределение. Използвани са корелации на ранг на Спирман за оценка на връзките между експресията на гена на оментин и други количествени променливи при не-амишите (несвързани) субекти, използвайки софтуерния пакет SAS 9.1 (SAS, Cary, NC).

РЕЗУЛТАТИ

Човешките плазмени проби съдържат откриваеми нива на оментин 1, но не и оментин 2 чрез двуизмерно Уестърн блотинг.

Нивата на човешкия плазмен оментин 1 корелират отрицателно с маркерите за затлъстяване и инсулинова резистентност.

Идентифициране на оментин 1 като основна изоформа на оментина в човешката плазма. Пречистеният оментин 1 (А), човешката плазма (В) и човешката плазма плюс екзогенен оментин 2 (С) се подлагат на двумерна гел електрофореза и Western blot с анти-човешки оментин моноклонално антитяло. Петната показват имунореактивен оментин 1 и 2 с pIs съответно ∼5,6 и 8,2.

Количествено определяне на нивата на оментин 1 в проби от човешка плазма. A: Плазмени проби („стандартна плазма“) от хора (маркирани с P1, P2 и P3) и пречистен оментин 1 при шест различни концентрации (маркирани с O1 – O6) бяха електрофорезирани в два екземпляра върху 10% SDS-PAGE гел, последван от Western попиване с анти-оментинови антитела. Б: Стандартната крива е конструирана чрез нанасяне на известни концентрации на оментин (•) спрямо техните оптични плътности в произволни единици. Концентрациите на оментин в плазмата (▵) бяха екстраполирани от тази стандартна крива.

Циркулиращите нива на оментин 1 намаляват при затлъстяване. Данните са средно ± SE. Слабите (n = 21), наднорменото тегло (ovw, n = 17) и затлъстелите (ob, n = 14) стойности за жените са съответно 0,41 ± 0,03, 0,32 ± 0,04 и 0,32 ± 0,05. Слабите (n = 18), наднорменото тегло (ovw, n = 13) и затлъстяването (ob, n = 8) за мъжете са съответно 0,33 ± 0,02, 0,30 ± 0,03 и 0,29 ± 0,03. Стойностите на P за сексуално стратифицирания анализ между трите групи при мъжете и жените (* P = 0,03 и ** P = 0,006, съответно) бяха определени чрез анализ на компонентите на дисперсията, адаптиран към възрастта, пола и семейната структура. Плазмените нива на оментин 1 са по-високи при слабите жени, отколкото при слабите мъже (*** P = 0,03).

Плазменият оментин 1 изравнява корелациите с маркерите за затлъстяване и инсулинова резистентност. Значими коефициенти на корелация, базирани на анализ на компонентите на дисперсията, коригирани за пол, възраст и фамилна структура бяха открити между плазмените нива на оментин 1 с ИТМ (n = 91, r = −0.34, P = 0.0007) (A); обиколка на талията (n = 91, r = -0,35, P = 0,0005) (B); Ln HOMA индекс (n = 91, r = -0,33, P = 0,002) (C); и плазмени нива на адипонектин (n = 91, r = 0,29, P = 0,005) (D).

Висцералният мастен оментин 1 и 2 нивата на експресия на гена се намаляват с ИТМ. Висцералният адипозен оментин 1 (А) и оментин 2 (В) съотношение мРНК копира до 18S РНК, измерено чрез количествена RT-PCR, са в отрицателна корелация с ИТМ (n = 20, rs = -0,62, P = 0,006; n = 20, rs = −0,73, P = 0,0006, съответно; корелациите на Спирман, коригирани за пол и възраст). В: Налице е значителна положителна корелация между нивата на експресия на оментин 1 и 2 (n = 20, rs = 0.76, P = 0.0002; корелация на Spearman, коригирана за пол и възраст).

Експресията на гена на оментин 1 положително корелира с концентрацията на човешки плазмен оментин 1. Съотношението на висцерален оментин 1 mRNA копира към 18S РНК, измерено чрез количествена RT-PCR, е положително корелирано с нивата на човешки плазмен оментин 1 (n = 14, rs = 0,60, P = 0,02; корелация на Spearman).

Демографски и клинични характеристики на субектите с AFDS, разделени на слаби, с наднормено тегло и групи със затлъстяване

Корелации на признаците, свързани с метаболитния синдром, с плазмените нива на оментин 1 при 91 субекти амиши

Благодарности

Това проучване е получило Национални институти по здравни грижи DK-620931983, AG-20116, GM-08663 и P30-DK-072488 и подкрепа от Администрацията за ветераните, Гериатричните изследвания, Образованието и Клиничния център.

Благодарим на Peter Gutierrez (Университет на Мериленд Център за рак на Гринебаум) и Julie Ray (Училище по фармация на University of Maryland) за анализа на масова спектрометрия.

Бележки под линия

Публикувано преди отпечатване на http://diabetes.diabetesjournals.org на 28 февруари 2007 г. DOI: 10.2337/db06-1506.

Разходите за публикуване на тази статия бяха покрити отчасти чрез плащането на такси за страница. Следователно тази статия трябва да бъде маркирана с „реклама“ в съответствие с 18 U.S.C. Раздел 1734 единствено, за да посочи този факт.

    • Приет на 20 февруари 2007 г.
    • Получено на 26 октомври 2006 г.
  • ДИАБЕТ