научна статия

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Допълнителни
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Изследователите са изследвали използването на животински модели, включително плъхове, мишки и морски свинчета, за оценка на алергенния потенциал (Knippels et al., 1999a; Piacentini et al., 2003; Vinje et al., 2009). Някои недостатъци ограничават използването на морски свинчета като подходящ модел, включително значителни разлики в имунофизиологията в сравнение с други видове и липса на инструменти за изследване на имунната му система (Ahuja et al., 2010). За мишките естествената сложност на алергичните реакции затруднява намирането на един надежден маркер за количествено определяне на сенсибилизационния потенциал на протеин (Aldemir et al., 2009). Плъховете обаче имат редица предимства в сравнение с други животински модели, особено по отношение на това, че са един от най-често използваните видове при тестване на токсичността. Те включват разумно количество знания за тяхната имунна система и наличието на много инструменти за изследвания, свързани с имунитета (Penninks and Knippels, 2001).

пълна

Задължително е да се отбележи, че понастоящем нито един от най-подходящите начини на експозиция не е валидиран при оценката на алергенността на новите протеини. На теория парентералното приложение на протеин избягва развитието на орална толерантност и дава ясна индикация за присъщата способност на протеините да индуцират отговори на IgE антитела. И все пак трябва да се признае, че естественият път на хранене по време на периода на сенсибилизация не е бил взет под внимание (Dearman and Kimber, 2001). Ясно е, че хранителните алергени могат да предизвикат анафилаксия чрез интра-стомашни, сублингвални, назални или кожни пътища; въпреки това оралното излагане на хранителни алергени се случва доста често, започвайки от най-ранните етапи от живота (Dunkin et al., 2011). Следователно в настоящото проучване ние изследвахме степента на алергични реакции в сравнение между плъхове BN и Wistar след орално излагане на овалбумин.

Материали и методи

Животни и алергени

Женски безвъзпитани плъхове Wistar и инбредни BN (всеки на възраст 4 седмици) са закупени от Vital River Company (Пекин, Китай) и поддържани на диета без яйца преди покупката. Всички плъхове се аклиматизират най-малко 5 дни преди започване на изследването. Животните се държат при специфични условия, свободни от патогени, поддържани при 23 (± 3) ° C и относителна влажност от 40–70% с цикъл светлина/тъмнина от 12 часа. Всички плъхове бяха настанени в клетки от неръждаема стомана на групи от по четирима и им бяха дадени ad libitum достъп до търговска диета без яйца за гризачи и дестилирана вода. Общинската комисия по наука и технологии в Пекин (NO. SYXK 2010-0036) одобри всички описани тук изследвания върху животни.

Сенсибилизация и предизвикателство

Плъховете бяха изложени чрез сонда на овалбумин (OVA, партида № A5503, Sigma, Сейнт Луис, Мисури) в дни 1 и 14 и след това всеки ден от ден 15 до ден 42; използваната доза е 150 ug OVA/g телесно тегло (BW; 1 ml/плъх). Контролите получават по 1 ml физиологичен разтвор всеки път. След този индукционен период плъховете не бяха изложени на OVA в продължение на 1 седмица. На 49 ден, всички чувствителни към OVA животни бяха орално предизвикани с OVA разтвор в дестилирана вода (750 µg OVA/g [BW], обем = 2 ml/плъх); контролните плъхове получават 2 ml физиологичен разтвор.

Кръвни проби бяха получени от орбиталния сплит в дни 0, 14, 28, 35 и 42. Всяка проба беше оставена да се съсирва за 1 h при стайна температура и след това се центрофугира при 3000 × g (10 минути, 4 ° C), за да се получи серуми за използване при анализи на антитела. Серумите в ден 0 бяха обединени и използвани като отрицателна контрола. Всички индивидуални и обединени серуми се съхраняват при -20 ° C до анализ. Проби за определяне на нивото на хистамин в плазмата и диференциално броене на клетки се събират отделно (в същите дни) в охладени епруветки EDTA-K2.

Определяне на титъра на антитела (IgE, IgG и IgG2a)

Всички обединени серуми от Ден 0 се използват като отрицателна контрола и всички тези проби се измерват при разреждане 1: 4. Средната абсорбция в ямките с отрицателна контрола (към която е добавено 3-кратно стандартно отклонение) дава референтната стойност за определяне на титъра (представен като log2 титър) във всяка проба от тествани серуми. За всеки тестов серум като титър на антителата се приема реципрочната стойност на най-отдалеченото разреждане на серума, даваща абсорбция, по-висока от референтната стойност.

Определяне на плазменото ниво на хистамин

Кръв се събира 30 минути след орално излагане на OVA или физиологичен разтвор на дни 14, 28 и 42. Кръвни проби от плъхове, събрани в охладени епруветки, се центрофугират при 3000 × g (10 минути, 4 ° C) за получаване на плазмени аликвотни части и се съхраняват при -80 ° C до анализ. След това се определят нивата на плазмен хистамин, като се използва комплект ELISA от плъхов хистамин (HIS) (партида № H026-10, Groundwork Biotechnology Diagnostics Ltd., Сан Диего, Калифорния), следвайки инструкциите на производителя. В този случай оптичната плътност във всяка ямка беше измерена при 450 nm в автоматизирания четец на микроплаки. Нивото на чувствителност на комплекта е 0,5 ng/ml.

Брой диференциални клетки

Кръвните проби, получени на 50-ия ден, се събират в охладени епруветки, съдържащи EDTA, и се анализират в рамките на 4 часа. Броят на базофилите, еозинофилите и неутрофилите в кръвта се определя с помощта на система за хематология на животните (тип Hemavet 950, Drew Scientific Inc., Dallas, TX).

Определяне на кръвното налягане

На 49-ия ден всички чувствителни към OVA плъхове бяха орално предизвикани с 2 ml OVA разтвор в дестилирана вода (750 µg/g · BW); контролните плъхове получават 2 ml физиологичен разтвор. За да се избегне стрес по време на експерименти, плъховете бяха адаптирани към маншета за кръвно налягане по време на периода на сенсибилизация. Преди стимулацията с високи дози се измерва изходното кръвно налягане на плъховете. По време на периода на измерване плъховете бяха затворени в малка тръба, обвита с топлоизолационна тръба, която беше поддържана при 20 ° С. Надуваем маншет под налягане беше поставен около опашката и дистално залепен сензор беше използван за регистриране на систолното кръвно налягане. Кръвното налягане се определя чрез неинвазивен маншет за кръвно налягане (тип BP-98A, Softron, Токио, Япония) на интервали от 7 часа.

Хистопатологичен анализ

Животните бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация 24 часа след оралното предизвикателство (т.е. на 50-ия ден). При аутопсия сърцето, черният дроб, далакът, белите дробове и бъбреците на всеки плъх се запазват в неутрален фосфатно буфериран 10% (обем/обем) формалдехид и се влагат в парафин. В случая на белите дробове това се случи след надуване с фиксатор. След това се приготвят срезове (с дебелина 6 µm), като се използват стандартни протоколи и след това тъканите се оцветяват с хематоксилин и еозин (Sigma).

Статистически анализ

Титрите на антителата между групите, плазмените нива на хистамин и номерата на подтиповете на имунните клетки са сравнени статистически, като се използва двустранен студент т-тест, съдържащ се в програмата SPSS 13.0 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс). Разликите се считат за статистически значими при стр-стойности ≤ 0,05.

За да се оценят промените на кръвното налягане при животни, предизвикани от OVA, горната и долната граница на 95% диапазона на доверие на стойностите на кръвното налягане, наблюдавани при контролните плъхове, бяха използвани като референтни. Спадът на кръвното налягане се счита за значителен, когато стойността на налягането падне извън долната граница на 95% диапазона на доверие (Knippels et al., 1999b).

Резултати

OVA-специфични титри на антитела (IgE, IgG и IgG2a)

Преди започване на експозицията се вземат кръвни проби и се подготвят серумни проби. Серумите бяха обединени и използвани като отрицателна контрола в тестовете ELISA. При орална сенсибилизация с OVA, OVA-специфични IgE отговори бяха открити при плъхове BN и Wistar на дни 0, 14, 28 и 42. За плъхове BN, OVA-специфичните IgE титри се увеличиха значително, с максимални OVA-специфични нива на IgE на 28-ия ден след започване на орални експозиции (Фигура 1а: log2 титър = 1,48 ± 0,42 [средно ± SD]) и след това леко намалява. При плъхове Wistar специфичните за OVA IgE отговори се откриват от 14-ия ден нататък, като максималните отговори се откриват на 42-ия ден (Фигура 1а: log2 титър = 1,62 ± 0,28).

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Ефекти върху специфичните за OVA нива на антитела. Нива на (a) IgE, (b) IgG и (c) IgG2a отговор при млади женски плъхове BN и Wistar в периода след орално излагане на OVA. OVA беше доставена на плъхове BN (♦) и Wistar (▪) на плъхове 1 и 14 и след това всеки ден от ден 15 до ден 42. В същото време контролните плъхове BN (▴) и плъховете Wistar (•) получиха същия обем физиологичен разтвор. Данните са представени като среден log2 титър (± SD) от шест плъха на група. a За плъхове BN или b Wistar, изложената на OVA група значително се различава от контролната при стр Фигура 1. Ефекти върху специфичните за OVA нива на антитела. Нива на (a) IgE, (b) IgG и (c) IgG2a отговор при млади женски плъхове BN и Wistar в периода след перорално излагане на OVA. OVA беше доставена на плъхове BN (♦) и Wistar (▪) на плъхове 1 и 14 и след това всеки ден от ден 15 до ден 42. В същото време контролните плъхове BN (▴) и плъховете Wistar (•) получиха същия обем физиологичен разтвор. Данните са представени като среден log2 титър (± SD) от шест плъха на група. a За плъхове BN или b Wistar, изложената на OVA група значително се различава от контролната при стр Алергични реакции в сравнение между плъхове BN и Wistar след орално излагане на овалбумин

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Ефекти върху освобождаването на хистамин. Освобождаване при млади женски (а) BN и (b) плъхове Wistar след орално излагане на OVA или физиологичен разтвор в дни 1 и 14 и след това всеки ден от ден 15 до ден 42. Белите ленти представляват контролите, а черните ленти на групите, изложени на OVA. Нивата на хистамин в плазмата са измерени с помощта на ELISA. Показани са средните стойности (ng/ml) с 95% CI (доверителни интервали) за различните групи. * Значително се различава от контрола при стр Фигура 2. Ефекти върху освобождаването на хистамин. Освобождаване при млади женски (а) BN и (b) плъхове Wistar след орално излагане на OVA или физиологичен разтвор в дни 1 и 14 и след това всеки ден от ден 15 до ден 42. Белите ленти представляват контролите, а черните ленти на групите, изложени на OVA. Нивата на хистамин в плазмата са измерени с помощта на ELISA. Показани са средните стойности (ng/ml) с 95% CI (доверителни интервали) за различните групи. * Значително се различава от контрола при стр Алергични реакции в сравнение между плъхове BN и Wistar след орално излагане на овалбумин

Публикувано онлайн:

Фигура 3. Ефекти върху нивата на гранулоцитите. Брой на (а) базофили, (б) еозинофили и (в) неутрофили в кръвта на млади женски плъхове BN и Wistar в периода след орално излагане на OVA или физиологичен разтвор (на 49-ия ден). Белите ленти представляват контроли, а черните ленти групи, изложени на OVA. Данните са представени като средно (± SD) от шест плъха на група. * Значително се различава от контрола при стр Фигура 3. Ефекти върху нивата на гранулоцитите. Брой на (а) базофили, (б) еозинофили и (в) неутрофили в кръвта на млади женски плъхове BN и Wistar в периода след орално излагане на OVA или физиологичен разтвор (на 49-ия ден). Белите ленти представляват контроли, а черните ленти групи, изложени на OVA. Данните са представени като средно (± SD) от шест плъха на група. * Значително се различава от контрола при стр Алергични реакции в сравнение между плъхове BN и Wistar след орално излагане на овалбумин

Публикувано онлайн:

Фигура 4. Ефекти върху кръвното налягане. Нива на промяна в стойностите на налягането на 49-ия ден при млади жени (a) BN и (b) плъхове Wistar след орално предизвикване с OVA (▪) или при контролни плъхове след орално предизвикване с физиологичен разтвор (♦) Показаните данни са средни стойности (± SD) на повторни измервания на кръвното налягане (в mm Hg) за отделни плъхове за период от 7 часа. Прекъснатите линии показват горната и долната граница на 95% доверителния диапазон на стойностите на кръвното налягане за контролните плъхове. Спадът на кръвното налягане се счита за значителен, когато стойността спадне под диапазона от 95% доверие.

Фигура 4. Ефекти върху кръвното налягане. Нива на промяна в стойностите на налягането на 49-ия ден при млади женски (a) BN и (b) Wistar плъхове след орално предизвикване с OVA (▪) или при контролни плъхове след орално предизвикване с физиологичен разтвор (♦). Показаните данни са средни стойности (± SD) на повторни измервания на кръвното налягане (в mm Hg) за отделни плъхове за период от 7 часа. Прекъснатите линии показват горната и долната граница на 95% доверителния диапазон на стойностите на кръвното налягане за контролните плъхове. Спадът на кръвното налягане се счита за значителен, когато стойността спадне под диапазона от 95% доверие.

Хистопатологични промени при чувствителни към OVA плъхове

Както е показано на допълнителни фигури S1-S5, контролните плъхове с физиологичен разтвор демонстрират нормална морфология в различните органи (напр. Сърце, бял дроб, черен дроб, далак и бъбреци), получени 24 часа след оралното предизвикване (т.е. на 50-ия ден). За разлика от тях, дифузна стеатоза в сърдечните тъкани и инфилтрация на еозинофили в белодробните тъкани се наблюдават главно при чувствителни към OVA плъхове BN. Чувствителните към OVA плъхове Wistar също са имали стеатоза в сърдечната и чернодробната си тъкан, но също така са показали макрофагални агрегати в далаците си, лека интерстициална пневмония в белите дробове и данни за тубуло-интерстициален нефрит. Таблица 1 обобщава броя на плъховете, които са имали различните лезии.

Публикувано онлайн:

Таблица 1. Хистопатологични промени при плъхове BN и Wistar, чувствителни към OVA.

Дискусия

IgE-зависимата алергична реакция се състои от две фази: индуцираща стъпка, при която имунната система на гостоприемника се сенсибилизира от алергена, завършвайки в производството на специфични IgE антитела, които се свързват със специфични рецептори на клетъчната повърхност на мастоцитите в целеви органи; втората стъпка е задействаща фаза, медиирана от свързването на алергена с тези IgE и стимулиращо освобождаване на медиатора (хистамин) от мастоцитите. За оценка на алергенността на хранителните антигени и двете фази трябва да бъдат изследвани чрез подходящи тестове (Fritsche, 2009).

Специфичните за OVA отговори на антитела са маркерите на индуциращата фаза. Чувствителните към OVA плъхове BN и Wistar показват значително по-високи OVA-специфични титри на антитела от 28-ия ден до 42-ия ден в сравнение с отрицателната контролна група. Въпреки това, OVA-специфичните IgE титри при плъхове BN са значително увеличени, с максимално ниво, наблюдавано на 28-ия ден след започване на орално излагане. За разлика от това, при плъховете Wistar, специфичните за OVA IgE отговори се откриват едва след ден 14. Тези наблюдения показват, че плъховете BN са по-чувствителни към OVA в сравнение с плъховете Wistar по отношение на IgE-зависимата алергична реакция. BN плъховете също показват намаляване на OVA-специфичните нива на IgE антитела при продължително орално излагане на антигена. Това вероятно се дължи, поне отчасти, на факта, че постоянното излагане през устата може да бъде свързано с развитие на орална толерантност, процес, задвижван от Т-регулаторни клетки и други свързани механизми (Ahuja et al., 2010). От друга страна, при плъхове Wistar се наблюдава почти непрекъснато увеличение на OVA-специфичните IgE титри.

Доказано е, че индукцията на специфично IgE антитяло неизменно се придружава от индукция на антиген-специфичен IgG (Vaz et al., 1970, 1971; Yamanishi et al., 2003). Това важи особено за подкласовете на IgG, които се регулират по начин, подобен на IgE (като заместители на IgE). При плъховете IgG2a антитялото е обект на подобна регулация на цитокините като IgE (Saoudi et al., 1993; Gracie and Bradley, 1996; Kimber et al., 2003). Оралното излагане на BN плъхове на OVA доведе до стимулирани отговори на IgG и IgG2a антитела, които обикновено се изразяват като по-високи титри в сравнение с тези в плъхове от Wistar, с изключение на IgG на 14 ден.

За по-нататъшно илюстриране на клиничните последици, свързани с всякакви промени в образуването на антитела, освобождаването на хистамин и/или популациите от имунни клетки, ефектите върху систолното кръвно налягане бяха измерени на 49-ия ден след започване на експозицията на OVA. Тези мерки от своя страна биха помогнали на способността ни да дефинираме по-добре механизмите, свързани с патологията на IgE-медиирани алергични реакции (Ahuja et al., 2010). Някои плъхове BN демонстрират временен спад на систоличното кръвно налягане, който се връща към нормалните стойности в рамките на 1 час, което е в съответствие с предишни проучвания (Knippels et al., 1999b; Knippels and Pennicks 2002; Jia et al., 2005). Някои плъхове Wistar обаче показват почти непрекъснато понижение на кръвното налягане след предизвикателство. Тъй като е установено, че тези клинични прояви са очевидни само при някои животни, тези резултати могат да бъдат взети, за да отразят ситуацията, наблюдавана и при пациенти с алергия към храни (Knippels et al., 1999b).

Заключения

Плъховете BN и Wistar, чувствителни към OVA, развиват различни имунни реакции и клинични прояви. Такива резултати ни подсказват, че двата щама на плъхове могат да се различават по своите имунологични механизми на алергия и, освен това, че не е имало връзка между имунните отговори и тежестта на клиничните симптоми. За да бъде ясно, данните от тези проучвания трябва да се разглеждат като „предварителни“, тъй като е изследван само един протеинов алерген. Съответно са необходими допълнителни проучвания за сравняване на алергичните реакции между плъхове BN и Wistar чрез използване на пречистени силни, слаби и неалергенни протеини въз основа на експеримента, който докладваме тук. В допълнение, тъй като съществува известна връзка между наличието на избрани медиатори на възпаление и клинични симптоми, оценката на нивата на тези медиатори може да има диагностична стойност и евентуално полезна за проследяване на тежестта на клиничните симптоми в бъдеще.

Бележка за читателите

Таблица 1. Хистопатологични промени при плъхове BN и Wistar, чувствителни към OVA.