Доклади

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

РЕЗЮМЕ

Възпалителното заболяване на червата (IBD) е резултат от хронично чревно възпаление и разрушаване на тъканите чрез отклоняващ се имунно-възпалителен отговор към променена чревна микробиота. Диетичната намеса се превръща в привлекателен път за терапия на колит, защото диетата е ключов фактор, определящ имунния отговор на лигавицата. Кверцетинът (QCN) е най-често срещаният в природата и основен представител на диетичните антиоксидантни флавоноиди, за които е доказано, че влияят върху прогресията на колита. Основният механизъм на QCN обаче върху чревната имуномодулация остава неясен. Тук нашето проучване демонстрира, че QCN с диета може да подобри експерименталния колит отчасти чрез модулиране на противовъзпалителните ефекти и бактерицидния капацитет на макрофагите чрез зависим от Heme оксигеназа-1 (Hmox1, HO-1) път. Предполага се, че QCN може да възстанови правилната чревна връзка гостоприемник с микроби, за да подобри колита чрез ребалансиране на провъзпалителната, противовъзпалителната и бактерицидната функция на ентеричните макрофаги. Следователно, модулирането на функцията на чревните макрофаги с диетично приложение на QCN за възстановяване на имунологичната хемостаза и балансиране на ентералната коменсална флора е потенциална и обещаваща стратегия за терапия на IBD.

статия

Въведение

Микробната колонизация е жизненоважна за развитието и хомеостазата на чревната имунна система [17]. Натрупващите се доказателства разкриват дълбоките промени в микробната екология на червата при пациенти с IBD и модели на мишки. Чревната микробиота е определена като ключов фактор за развитието на IBD 18–20]. В червата имунната реактивност към коменсалната флора трябва да бъде ограничена, за да се предотврати патологично възпаление [21]. От включените имунологични параметри макрофагите си сътрудничат, за да насърчат толерантността към коменсалната флора, като същевременно позволяват реактивност към патогени. Дисбалансът на имунната защита и толерантността между чревната микробиота и макрофагите може да инициира и насърчи патологичния процес, лежащ в основата на IBD [22]; следователно, балансирането на коменсалната микробиота и ремоделирането на функциите на макрофагите може да служи като ефективна стратегия за лечение на IBD.

Резултати

Прилагането на QCN намалява възпалението на червата при колитични мишки

Публикувано онлайн:
Публикувано онлайн:
Публикувано онлайн:

За да демонстрираме защитните ефекти на QCN върху колит, които са резултат от регулиране на имунологичната функция на макрофагите, изчерпахме макрофагите в дебелото черво на мишки чрез инжектиране на липозоми, съдържащи клодронат (CDL). Изчерпването in vivo на макрофаги частично противодейства на терапевтичните ефекти на QCN в индуциран от Т-клетки колитичен модел на мишка по отношение на съотношението тегло/дължина на дебелото черво Фиг. 4А), дебелина на лигавичната стена Фиг. 4В) и хистологичен резултат Фиг. 4C).

Публикувано онлайн:
Публикувано онлайн:

Газотрансмитерът въглероден окис (CO) се генерира от ензима HO-1, реагиращ на стреса, който е силно индуциран в макрофаги в отговор на бактериална инфекция [38]. Въз основа на нашите in vivo констатации, ние предположихме, че пътят HO-1/CO може да участва в QCN-усиления капацитет за изчистване на бактериите на макрофагите. Нашите данни показват, че QCN повишава бактерицидната активност чрез изтриване на вътреклетъчното Е. coli в BMDM Scr клетъчна група, докато не успя да го направи в BMDM Hmox1siRNA клетъчна група Фиг. 5D). Фактът, че QCN-усиленият бактерициден капацитет на BMDMs е неутрализиран от Sn-протопорфирин (SnPP), който може да предотврати образуването на ендогенни CO, потвърждава участието на CO в QCN-индуцирания път HO-1 Фиг. 5E).

Фаголизозомното съзряване е показател за бактерицидната активност на макрофагите. За по-нататъшна проверка на способността на HO-1 да медиира QCN-усиления бактериален клирънс на макрофаги, BMDMs бяха инкубирани с LysoTracker® Red DND-99, слаба основа, която прониква в клетъчните мембрани и флуоресцира при протониране в среда с ниско рН, за откриване фаголизозома. В сравнение с контрола на PBS, QCN значително увеличава фаголизозомното образуване в BMDM Scr клетки, които са били предизвикани с Е. coli, но те не успяха в BMDM Hmox1siRNA клетки, предизвикани с Е. coli Фиг. 5F).

Предвид фагоцитния характер на LP макрофагите и тяхната значителна индукция при мишки, лекувани с QCN, предположихме, че третирани с QCN макрофаги ще увеличат клирънса на коменсални бактерии, които получават достъп до MLN. За да тестваме това, анализирахме MLN от тези мишки, за да ги оценим за признаци на бактериална транслокация. Общите MLN клетъчни суспензии, култивирани върху LB агарови плаки, разкриха наличието на по-малък брой бактерии при мишки след QCN обработка (Фиг. 5G).

Колективно тези данни разкриват, че HO-1 и неговият биоактивен продукт CO участват в индуцирания от QCN бактериален клирънс на макрофагите.

Лекуваните с QCN макрофаги потискат индуцирания от DSS колит по пътя HO-1

За допълнително потвърждение, че пътят HO-1 участва в защитните ефекти на QCN върху колит, лекуваните с QCN или PBS BMDM са прехвърлени в мишки на ден 1 и ден 4 след приложението на DSS. На 6-ия ден мишките, прехвърлени с лекувани с QCN BMDM, бяха значително защитени от колит в сравнение с тези, прехвърлени с лекувани с PBS BMDM (фиг. 6А). За разлика от BMDM Scr, прехвърлянето на BMDM Hmox1siRNA не показва забележим ефект върху модулирането на DSS-индуциран колит Фиг. 6A – 6C). Експресията на проинфламаторни цитокини IFN-γ, IL-17A и TNF-α в дебелото черво се регулира надолу след прехвърлянето на лекуван с QCN BMDM Scr от третиран с PBS BMDM Scr, докато понижаването на цитокините не може да бъде открито при заглушаване на HO-1 израз Фиг. 6D). Освен това броят на Е. coli е по-слабо изразена в дебелото черво от мишки, прехвърлени с QCN-третирана BMDM Scr, отколкото в тази на PBS-третирана BMDM Scr трансферна група. Няма обаче съществена разлика между броя на Е. coli между лекувани с QCN и третирани с PBS BMDM Hmox1siRNA трансферни групи Фиг. 6Е).

Публикувано онлайн:

Следователно нашето проучване демонстрира, че QCN може да подобри експерименталния колит, отчасти, чрез модулиране на противовъзпалителните ефекти и бактерицидната активност на макрофагите чрез зависим от HO-1 път. Диетичното приложение на QCN за възстановяване на чревна имунна хемостаза и баланс на ентералната коменсална флора е потенциална и обещаваща стратегия за терапия на IBD.

Материали и методи

Животни и лечение

Мишки OT-II и Rag1 -/- мишки с фон C57BL/6 и мишки C57BL/6 са закупени от Института за биомедицински изследвания в Нанкин на Университета в Нанкин (Нанкин, Китайска народна република). Всички протоколи за животни са одобрени от Институционалната лаборатория за грижа и употреба на животните към университета Soochow (Суджоу, Китайска народна република).

Индукция на колит

Адоптивен модел на трансфер на Т-клетки при хроничен колит. Т-клетъчно-медиираният колит се индуцира при Rag1 -/- мишки чрез адоптивен пренос на CD4 + CD25 - CD62L + Т клетки, които са сортирани с помощта на потоков цитометър FACSAria II (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Получателите на Rag1 -/- получават 5 × 10 CD4 + CD25 - CD62L + Т клетки чрез интраперитонеално инжектиране и мишките се евтаназират на 6-7 седмици след трансфера. Някои реципиентни мишки също перорално получават 10 mg/kg телесно тегло QCN или PBS веднъж на всеки 3 дни в продължение на 7 седмици след трансфера на CD4 + CD25 - CD62L + Т клетки. Индексът на активността на заболяването (DAI) и хистологичните резултати бяха определени, както беше описано по-рано [52-55].

Химично индуциран колит модел. Колит се индуцира при 8- до 12-седмични мишки C57BL/6J чрез добавяне на 2,5% (тегло/обем) DSS (36-50 KD молекулно тегло; MP Biomedicals, Solon, OH, USA) в тяхната питейна вода. За прехвърляне на BMDMs, BMDM Hmox1siRNA или BMDM Scr се третират с чревен бактериален антиген (20 ug/mL) в продължение на 48 часа в присъствието на PBS или QCN. BMDM се инжектират интравенозно (3 × 10 6) във всяка реципиентна мишка на 1 и 4 ден от DSS лечението. Ежедневно се наблюдават телесното тегло, консистенцията на изпражненията и стомашно-чревното кървене. Оценяват се клинични резултати и оценки на увреждане на дебелото черво, както е подробно описано по-рано [56]. Дебелото черво се събира веднага след умъртвяването и лигавицата се остъргва, за да се изолира общата РНК или протеини.

Реагенти, антитела и поточна цитометрия

QCN и LPS са закупени от Sigma-Aldrich Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). SnPP (30 μM) са закупени от Frontier Scientific Inc. (Logan, UT, САЩ). Белязани с флуорохром антитела са закупени от Biolegend, освен ако не е посочено друго: IL-17A (TC11-18H10.1; eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ); анти-IL-4 (11B11); анти-IL-10 (JES5–16E3, eBioscience); анти-IFN-γ (XMG1.2), анти-Foxp3 (FJK-16s, eBioscience); анти-CD11b (M1/70); анти-CD4 (RM4-5); анти-CD3 (145-2C11); анти-Gr-1 (RB6-8C5); анти-Ly6G (1A8); и анти-CD45 (30-F11). За анализ на повърхностни маркери, клетките се оцветяват в PBS, съдържащ 2% (тегло/обем) BSA. Клетките се оцветяват с подходящата смес от антитела. За откриване на вътреклетъчни цитокини, клетките първо се стимулират в продължение на 4 часа с 50 ng/ml РМА и 1 µg/ml йономицин в присъствието на Брефелдин А (5 µg/ml; всички получени от Sigma-Aldrich Co.), последвано от оцветяване за повърхностни маркери. След това клетките бяха фиксирани и проникнати с помощта на Foxp3 Fix/Perm Buffer Set (eBioscience) и оцветени за вътреклетъчни цитокини. Данните за поточната цитометрия бяха получени на FACSCalibur (BD Biosciences) и анализирани с помощта на софтуера FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Сортирането на клетки се извършва с помощта на FACSAria II.

Хистология и имунохистохимия

Образците на тъкани бяха фиксирани в 10% формалин, дехидратирани и след това вградени в парафин; Срезите с дебелина 2–4 μm бяха оцветени с хематоксилин и еозин. За анализ на имунофлуоресценцията, тъканните срезове бяха подложени на извличане на антиген чрез кипене на предметните стъкла в антиген демаскиращ разтвор (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) в продължение на 10 минути, съгласно инструкциите на производителя. След това секциите бяха блокирани за 1 час при 22 ° С с 5% BSA в PBS и инкубирани с антитела срещу Ki67 (eBioscience), миши моноклонални анти-Е-кадхерин, анти-CD11c, F4/80 и CD11b (BD Biosciences) и те бяха използвани в разреждане 1/250, последвано от конюгиран с Alexa488 анти-кози имуноглобулин (Ig) G или маркиран с Alexa594 анти-заешки IgG (1: 600; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Тъканите бяха оцветени с DAPI и изображенията бяха заснети на конфокален микроскоп Leica SP5 II (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия). За имунохистохимичен анализ на дендритни клетки или макрофаги, вградени в OCT (Sakura Finetek) тъканни криосекции (с дебелина 5 μm) бяха оцветени с CD11c или F4/80 (BM8; eBioscience).

16S рДНК генетичен анализ на бактерии

ДНК се екстрахира от съдържанието на дебелото черво на лекувани с QCN и нетретирани мишки и се анализира чрез количествена PCR в реално време, използвайки общи 16S рДНК праймери (ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT и ATTACCGCGGCTGCTGGC). Относителното изобилие от 16S рДНК за всяка насочена бактериална група беше изчислено по метода ΔCT и нормализирано до количеството на общите 16S рДНК в пробата.

Екстракция на РНК и PCR

Общата РНК се приготвя от изолирани тънки чревни епителни клетки, като се използва RNeasy Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя. Общата РНК (1 μg) беше подложена на обратна транскрипция, използвайки произволни хексамери и Superscript II (Invitrogen), последвано от количествен PCR анализ. За количествено определяне на гените, които представляват интерес, пробите от cDNA бяха амплифицирани в PCR система в реално време LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Манхайм, Германия) със SYBR Green Master Mix (Invitrogen) и специфични праймери (допълнителна таблица 1), в съответствие с инструкциите на производителя . Промени в експресията на иРНК между леченията и контролите се определят чрез метода ΔCT, както е описано [57]. Лентите за грешки на графиките представляват ± стандартна грешка на средната стойност (SEM), освен ако не е посочено друго. Данните бяха нормализирани към референтна GAPDH. Всички грундове са закупени от Sangon Biotech (Шанхай, Китайска народна република).

ELISA

Количеството IL-17A, IL-6, TNF-α, IL-10 и IFN-γ (eBioscience) се определя в супернатантите на културата, тънките черва и дебелото черво с помощта на ELISA комплекти, съгласно инструкциите на производителя. Чувствителността на анализа е 5 макрофага и 8 × 10 5 OT-II Т клетки се смесват допълнително в присъствието на сроден пептид (5 μg/mL; OVA). След 4 дни култивиране, живи Т клетки се събират и стимулират с РМА (форбол 12-миристат 13-ацетат; 50 ng/ml) и йономицин (1 ug/ml; Sigma-Aldrich Co.) плюс брефелдин А (10 ug// mL; Sigma-Aldrich Co.) за вътреклетъчно оцветяване на цитокини или за анализ на иРНК. тРНК беше оценена чрез PCR в реално време и супернатантите бяха използвани за измерване на цитокини чрез ELISA.

Изолиране на Lamina propria лимфоцити (LPL)

Методът, използван за изолиране на LPL, е описан по-рано [58]. Накратко, мастните тъкани и РР бяха отстранени от тънките черва. Червата бяха отворени и нарязани на парчета с дължина 1 cm и инкубирани в разтвор на HBSS, съдържащ 5 mM EDTA и 10 mM Hepes в продължение на 30 минути при 37 ° C с бавно въртене (180 rpm min -1). След това парченцата бяха допълнително нарязани и инкубирани в разтвор на HBSS, съдържащ 0,5 mg ml -1 DNase I (Roche, Базел, Швейцария) и 1 mg/ml -1 колагеназа тип IV (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA). И накрая, разтворът, съдържащ усвоена тъкан, се прекарва през 100 μm клетъчно цедка и LPL се възстановяват на границата на 40% и 80% Percoll (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA). За анализ на поточна цитометрия клетките се маркират, като се използват стандартни процедури, както е описано по-горе.

Изолиране на антигени на чревни бактерии за in vitro клетъчна култура

Съдържанието на пресни фекалии се събира и внимателно ресуспендира в PBS (0,01 g/ml). Получената суспензия се центрофугира при 400 х g за 5 минути, за да се отстранят по-големите частици от бактериите. След това бактериалните суспензии се лизират чрез физическо разрушаване чрез ултразвук. Концентрацията на протеин в лизата се определя количествено с теста на Брадфорд за протеини. Използвахме 20 µg/ml общ GBA за in vitro стимулация.

Western blot анализ

Уестърн блотинг се извършва със стандартни протоколи, използващи BMDM или тъкан на дебелото черво. Първични антитела, реактивни на заешки антимиши HO-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), заешки антимиши Nrf2 поликлонални антитела (Santa Cruz Biotechnology), заешки моноклонални анти-GAPDH антитела (D16H11, Cell Signaling Technology, Използвани са Danvers, MA, САЩ) и β-актин (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA). Петната се измиват три пъти в TBST за 30 минути, инкубират се с конюгирани с пероксидаза от хрян вторични антитела (разреждане 1: 5000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) за 20 минути, промиват се три пъти в TBST и се визуализират с повишена хемилуминесценция.

Генериране на BMDM

За генерирането на миши макрофаги, клетките на костния мозък се събират от бедрените кости и пищялите на мишките и се култивират в шест ямкови плаки за тъканна култура (Costar) в продължение на 8 дни в пълна среда, допълнена с 20 ng/ml M-CSF. PBS или QCN се добавят към някои ямки от ден 5.

Малка интерфектираща трансфекция на РНК

BMDMs бяха трансфектирани с Hmox1 малка интерферираща РНК (siRNA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), използвайки липофектамин RNAiMAX трансфекционен реагент (Thermo Fisher Scientific). Контролирана скремблирана siRNA е закупена от Thermo Fisher Scientific.

Анализ на фаголизозомно подкисляване

BMDM от WT мишки се инкубират със SnPP (30 μM) за 1 час. След това клетките бяха третирани с LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) при концентрация от 100 nmol/L за 30 минути, както и с Е. coli за 1 час, фиксиран в 4% параформалдехид и оцветен с ядрено оцветяване Topro-3 (5 nmol/L; Invitrogen). Клетките се визуализират с помощта на конфокална микроскопия с конфокален микроскоп Leica SP5 II (Leica Microsystems). Преброени са поне 10 мощни полета и 100 клетки.

Анализ за защита на гентамицин

BMDM (1 × 106) се култивират в присъствието на PBS или QCN и след това се инкубират с Е. coli при съотношение 10: 1 в среда без антибиотици за 1 час. След това клетките се измиват с PBS плюс гентамицин (200 μg/mL) и се инкубират в среда, допълнена с гентамицин (200 μg/mL) при 37 ° С за допълнителен час, за да се елиминират извънклетъчните бактерии. Към клетките се добавя нова среда, допълнена с гентамицин (100 μg/mL). В някои експерименти SnPP (30 μM) се добавя към клетките след елиминиране на извънклетъчните бактерии. Клетките се лизират с 1% Triton X-100, разреждат се, посяват се върху мозъчно-сърдечни инфузионни плочи с агар и се инкубират при 37 ° С. Единиците, образуващи колонии (CFU), изчислени за 1 час, отразяват общото поглъщане на бактерии (фагоцитоза). CFU, възстановени след 12 часа, представляват процентното оцеляване на всички бактерии, фагоцитирани в 1-часова времева точка.