Статии

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Въведение

Това разследване ще установи зебрата като модел за анализ на генотипни и фенотипни характеристики при метаболитно заболяване, като затлъстяване чрез диета, и потенциалът на канелата за подобряване на ефектите от неблагоприятната диета може да бъде изследван. Канелата е известна с това, че намалява физическия вид затлъстяване, особено около корема и за стабилизиране на нивата на кръвната глюкоза, което позволява на субектите да се чувстват по-сити за по-дълъг период. Предполага се, че канелата ще бъде в състояние да намали някои от генотипните и фенотипните характеристики, свързани със затлъстяването в установения модел на зебра.

статия

Материали и методи

Отглеждане на зебра

Зебраните се поддържат при регулирана температура от 28 ° С при 14 часа светлина: 10 часа тъмен цикъл. Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с насоките, одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните при д-р B.R. Център за биомедицински изследвания Ambedkar, Университет в Делхи, Делхи, Индия.

Процедури за хранене на зебра

Изследвани са три основни групи риби, на които са дадени различни храни (използвани са мъжки зебра от див тип от щама AB). Мъжките AB риби от зебра са разделени на три групи: Първата група е създадена като контрол чрез хранене на редовно количество от скаридите Артемия; втората група е предизвикана от затлъстяване чрез прекомерно хранене с Артемия; третата група е предизвикана от затлъстяване чрез прекомерно хранене с Артемия но която също е хранена с канела на прах (Cinnamomum zeylanicum).

Нормална група за хранене (5 mg от Артемия/ риба/ден) - група NF

Група за прехранване (60 mg от Артемия/ риба/ден, хранени по 20 mg три пъти дневно) - група OF

Прехранване + група канела (60 mg от Артемия/ риба/ден, хранени 20 mg три пъти дневно + 2 mg канела на прах/риба/ден, хранени три пъти дневно 20 минути преди Артемия хранене) - C + OF група

Зебраните се поддържат при 5 риби на резервоар; Използвани са 36 резервоара от по 5 риби, като по време на експеримента по 12 резервоара за всяка хранеща група. Процедурите за хранене, използвани в това проучване, са последвани от предишно проучване на Oka et al. [20]. Извършен е анализ на кръвната глюкоза и плазмените триглицериди, както и оцветяването с масло в червено и количествената RT-PCR. Всяка процедура използва 2 резервоара от по 5 риби. Тъй като бяха анализирани 10 риби на експеримент, индивидуалното проследяване на рибите не беше възможно, дължината и свързаните параметри бяха осреднени за проба. 3–4 седмици прехранване с Артемия е достатъчно, за да предизвика затлъстяване при данио и този модел наподобява реалността на затлъстяването при хората.

Измерване на телесното тегло и дължината на рибите

Както преди началото (седмица 0), така и в края (седмица 4) на експериментите за хранене, се измерва телесното тегло и дължината на анестезираните зебра. За да се направят измервания, рибите се упояват, като се използва буфериран трикаин. Трикаинът се приготвя при концентрация 0,02% във водата на съоръжението и рибите се прехвърлят в бехерова чаша, съдържаща сместа. След това те бяха наблюдавани за етап III на анестезия, при който имаше загуба на равновесие, загуба на движенията на оперкулума и загуба на реактивност. Този етап обикновено се достига за минута, след което могат да се направят измервания. Телесното тегло в грамове се измерва чрез изваждане на теглото на чаша с вода от съоръжението с рибата от теглото само на чашата с водата на съоръжението; използвайки скалата на Zebrafish Facility. Теглото се определя всяка седмица по време на експеримента. Рибите бяха оставени да се възстановят от упойката. Дължината в cm се измерва от най-предната точка на устата до най-задната най-задна част на опашния дръжка с помощта на владетел след вземане на телесно тегло. Дължината на всяка група е измерена на седмица 0 и седмица 4 времеви точки.

Анализ на нивата на кръвната захар

Нивата на кръвната захар на гладно се анализират от гръбната артерия с помощта на глюкозен метър (Accu-Chek, Roche). Рибите бяха лишени от храна през нощта и упоени с трикаин, преди да бъде направено гръбното изрязване на гръбната артерия. Кръвта беше взета с пипета и прехвърлена в лента за измерване на глюкоза; по начин, подобен на този, използван от диабетици.

Анализ на нивата на серумни триглицериди

За анализ на серумни нива на триглицериди, кръвни проби се събират от гръбната артерия и се събират от всички зебри на всяка група за хранене за всеки експеримент за хранене. Кръвта беше събрана и прехвърлена в епруветка за микроцентрифуга и инкубирана при стайна температура за 30 минути. След това епруветките с микроцентрифуга се центрофугират при 5000 об/мин при стайна температура в продължение на 15 минути, след което серумът се отделя и се подлага на анализ на нивото на триглицеридите, като се използва комплект за определяне на серумен триглицерид (Sigma) в съответствие с инструкциите на производителя.

Хистопатологичен анализ на данио

Зебрафините са евтаназирани след анестезия с 0,1 mg/ml трикаин (Sigma-Aldrich) (изходно ниво, след 2 седмици, след 4 седмици диета). Черният дроб се фиксира с помощта на 10% буфериран разтвор на формалин (Histo-Fresh), за да се запази качеството на тъканите. След това тъканите се поставят в разтвор на захароза при 4 ° С за 3 часа, след което бързо се замразяват в охладен с течен азот изопентан. След това те бяха вградени в Tissue-Tek и дисектирани с помощта на криостат. Замразените 5 μm криостатични секции се оцветяват с 0,5% масло червено O (лабораторни доставки BDH) в пропилей гликол и се оцветяват с хематоксилин на Carazzi (Sigma-Aldrich). Пробите бяха наблюдавани с помощта на светлинна микроскопия Zeiss Axiovert 40 CFL Microscope. Изображенията са получени с вградена цветна камера AxioCam. Чернодробната стеатоза е количествено определена чрез измерване на площта на хепатоцитите с помощта на софтуера ImageJ на National Institutes of Health (http://rsbweb.nih.gov/) [35].

Количествена RT-PCR

Чернодробните тъкани се дисектират от рибата зебра и се добавят в Trizol (Invitrogen) преди хомогенизиране. Изолирането на РНК се извършва с 200 µl хлороформ, 500 µl изопропилов алкохол, 500 µl 75% етанол и 30-50 µl вода без РНКаза. Количественото определяне на РНК се извършва с помощта на спектрофотометър Nanodrop. Впоследствие се извършва cDNA синтез с Oligo (dT) 18, 10 mM dNTP, 5X буфер, 0.1 mM DTT, RNase OUT и SSIII обратна транскриптаза. И накрая, посяването беше направено с 2X Sybr Green Master Mix (Bio-Rad) и бяха генерирани количествено следните гени, свързани с метаболизма: PPARAB, NR2F2, PPARGC1AL, ALDOCA, LDLR, PDE4BA, FOXO1, SREBF1, SREBF2, RARGA, с ACTB като ендогенен контролен ген (Таблица 1).