Принос от Diter von Wettstein

ечемичен

Резюме

Според Националната служба за земеделска статистика на Министерството на земеделието на САЩ (1998 г.) годишното производство на пилета-бройлери в САЩ се е увеличило от 5 милиарда птици през 1987 г. на 7,5 милиарда през 1996 г. Потреблението на пилешко месо на глава от населението е нараснало от 68 до 88 паунда годишно, което съответства на общо нарастване от 16,9 на 23,9 милиарда паунда на консумация на бройлери през 10-годишния период. Приблизително 4,4 lb фураж са необходими за производството на 1 lb живо пиле, а преобладаващата част от фуражите, използвани за това производство на месо, се основават на царевично зърно. Ечемикът е неприемлив компонент в фуражите за пилета, тъй като е с ниска метаболизираща енергия. Храненето с диети с ечемик на домашни птици води до ограничено усвояване на хранителни вещества, бавен първоначален растеж и лепкави изпражнения, прилепнали към клоаката и пухчето на пилето, както и към подовете на производствените клетки.

Причината за ниската хранителна стойност на ечемиченото зърно беше открита, когато към диетите с ечемик бяха добавени сурови гъбични или бактериални ензими или 2,5% малц (1–4). Това подобри наддаването на тегло и облекчи проблемите с лепкавия тор. Рикес и колеги пречистиха първата (1,3–1,4) -β-глюканаза от щам Bacillus subtilis, сега обозначен като Bacillus amyloliquefaciens, и демонстрираха положителен отговор на растежа при пилетата, когато пречистеният ензим беше добавен към диета с ечемик (5). Бактериалният ензим деполимеризира ечемика (1,3–1,4) -β-глюкан и има същата субстратна специфичност като ендогенния ечемичен ензим (6). Допълването на диетата с ечемик със сурови ензими от културални филтрати от Trichoderma reesei под формата на търговски препарати GV-P (Grindsted Products, Grindsted, Дания) и Onozuka 3S (Serva) доведе до значително значително увеличение на теглото и облекчаване на лепкавия тор (7–10). По този начин стана ясно, че на птиците липсва ензим, който може да деполимеризира (1,3–1,4) -β-глюкан, основният компонент на клетъчните стени на ечемичния ендосперм.

Филтратите от култура на T. reesei съдържат няколко хидролази, които деполимеризират целулозата [(1,4) -β-глюкан], (1,3) -β-глюкан и (1,3–1,4) -β-глюкан (11– 14). Клонирането на структурния ген за T. reesei ендоглюканаза I (15) го идентифицира като целулаза по неговата първична структура. Хетероложната експресия на гена в ечемични суспензионни културни клетки води до секрецията му в хранителната среда. Експериментите със смесване показаха, че този ензим деполимеризира ечемик (1,3–1,4) -β-глюкан и показва значителна топлинна стабилност (16). Смесеният свързан (1,3–1,4) -β-глюкан в стените на ендосперма на ечемика се състои от 90% полизахаридни вериги, даващи при разцепване с пречистен ечемик (1,3–1,4) -β-глюканаза целотриозил (G4G4G ) и остатъци от целотетраозил (G4G4G4G4). Тези (1,4) свързани блокове от β-гликозилови остатъци са разделени чрез единични (1,3) -връзки (17). Целулазата на Trichoderma деполимеризира ечемичния смесен свързан β-глюкан чрез хидролизиране на глюкозилови 1–4 връзки в блоковете cellotriosyl и cellotetraosyl, докато ечемикът и Bacillus (1,3–1,4) -β-глюканазите специално разцепват 1–4 връзка, съседна на 1-3-свързана глюкоза (14, 17, 18). Това обяснява защо и трите ензима могат да насърчат хранителните подобрения на диетата с ечемик.

(1,3–1,4) -β-глюканите в клетъчните стени на ендосперма на ечемика се състоят от две фракции, една, която е водоразтворима при 40–65 ° C, и друга, която е неразтворима във вода. Последният изисква киселинна или алкална хидролиза или силно пречистени ензими за деполимеризация до по-малки фрагменти, които стават водоразтворими и след това могат да бъдат анализирани. Woodward и сътр. определя химическата структура и физикохимичните свойства на водоразтворимия ечемик (1,3–1,4) -β-глюкани (17–19). Тези глюкани се състоят от популация от молекули с молекулно тегло от 10 4 до 10 7 и са отговорни за високия вискозитет на разтворите на β-глюкан. Водоразтворимите β-глюкани са причинителите на проблеми при храненето на пилета, малцоването и варенето (преглед в справка 14). Неразтворимата във вода фракция не влияе на вискозитета. Един килограм малцово или фуражно ечемичено зърно съдържа обикновено около 50 g (1,3–1,4) -β-глюкан, когато зрее в сухи условия или около 30 g, когато пълненето на зърно се извършва при дъждовни условия (20–23). Водоразтворимата част възлиза на съответно 10 и 5 g⋅kg -1 при двете условия на узряване.

Hesselman и Åman (25) са проследили смилането на нишесте и (1,3–1,4) -β-глюкани в различни участъци на червата на пилета след третиране на диетата с ечемик с ензими, деполимеризиращи (1,3–1,4 ) -β-глюкани. Храносмилането на нишесте е било възпрепятствано от диетата с ечемик в горните отдели на тънките черва, но е било много обширно, когато диетата е била лекувана с ензим. Не е открит (1,3–1,4) -β-глюкан в цекума на пилетата със или без предварителна обработка на диетата с ензим. Предполага се, че това отсъствие се дължи на засилена агресивна микробна флора, която също е довела до повишеното съдържание на сухо вещество в дебелото черво. Предполага се, че продуктите на цекалната микрофлора са отговорни за лепкавия тор, а не за (1,3–1,4) -β-глюканите.

В предишно съобщение (26) сме докладвали за два комплекта трансгенни ечемичени растения, които експресират синтетичен за кодон оптимизиран ген, кодиращ разработена от протеини термотолерантна (1,3–1,4) -β-глюканаза. Единият набор произвежда рекомбинантния ензим с помощта на ендоспермен специфичен генен промотор в развиващото се зърно, а другият - с алеурон-специфичен промотор на гена на а-амилаза по време на покълване/малцуване за секреция в ендосперма (27, 28). Термотолерантната (1,3–1,4) -β-глюканаза H (A12-M) ΔY13 (H, хибридна; A, аминокиселини от B. amyloliquefaciens; M, аминокиселини от Bacillus macerans) е хибриден ензим, получен от ензимите от двата вида. Той показва полуживот> 4 часа при 70 ° C (29). Неговата първична триизмерна структура е много различна от ендогенния ензим ечемик, а специфичната му активност и Vmax са ≈200 пъти по-високи от ензима ечемик. Оптимумът му за рН е между 6 и 7 и по този начин е изключително подходящ за деполимеризация на β-глюкани в дванадесетопръстника, илеума, ректума и цеца на пилето, при което рН на съдържанието варира от 5,7 до 7,0 (30). Но ензимът е ефективен и при по-ниски стойности на рН от 4,5 до 5,0, характерни за съдържанието в реколтата, жлезистия стомах и стомаха на птицата.

В настоящото разследване ние изследвахме растежа на пилета, хранени с ечемичена диета, допълнена с малц, съдържащ рекомбинантната термостабилна (1,3–1,4) -β-глюканаза, и я сравнихме със стандартна диета на основата на царевица, диета с ечемик без добавен малц и диета с ечемик с добавяне на нормален малц. Честотата на лепкавите изпражнения е регистрирана и β-глюканите са анализирани (31, 32) в различните части на стомашно-чревния тракт, както и в екскрементите. Наличието на рекомбинантен ензим в жлезистия стомах, черва, цеца и екскременти се проследява чрез измервания на активността и диагностични Western blots.

Материали и методи

Експериментални животни и условия.

Опитът с пилешко месо е извършен с 240 бройлери с висок добив Hubbard (Fors Farms, Puyallup, WA). Еднодневни пилета бяха прехвърлени в електрически отопляеми звена на Petersime Brood с повдигнати подове (Petersime Incubator, Gettysburgh, OH). Всяка от четирите експериментални диети беше разпределена на случаен принцип между 12 кошари и 5 птици, разпределени произволно на писалка. Храната и водата бяха на разположение по желание и се поддържаше 16-часова дневна светлина. Всички експерименти с животните са извършени с одобрение от Комитета за грижа и употреба на животните в Университета на Вашингтон. Комитетът следва насоките, установени от Канадския съвет за грижа за животните от 1980 г. (33).

Състав и подготовка на диетата.

Пилетата бяха хранени с четири смлени диети със състава, даден в таблица 1: базал от царевица, базал от ечемик (cv. Golden Promise), диета с ечемик с малц от Golden Promise, несъдържащ β-глюканаза, и диета с ечемик с малц от трансгенна линия 5607, съдържаща топлина -стабилна β-глюканаза. Малцът беше приготвен с помощта на микромащабно оборудване за малцуване, предлагано в Катедрата по култури и почви, Вашингтонския държавен университет. Убиването се извършва при 45 ° С в продължение на 6 часа и 80 ° С в продължение на 4 часа, за да се деактивира ендогенната β-глюканаза, присъстваща в покълнал ечемик. Малцът беше добавен за сметка на ечемика в размер на 6,2% от общата диета.

Състав на диетите в тегловни проценти

Събиране на данни по време на изпитанието.

5-те птици във всяка кошара бяха претеглени в дни 0, 6, 13 и 20. Консумацията на фураж по отделна кошара беше определена като разлика между първоначалното тегло на фуража за всяка кошара и теглото на фуража в деня на определяне. Кумулативната ефективност на фуража на пиле се изчислява като съотношение на натрупаното тегло към консумираната храна. Сухото вещество на екскретите се определя на 5, 8, 11, 14, 17 и 20 ден чрез събиране на изпражненията и сушенето им в продължение на 6 часа при 105 ° С. Броят на пилетата с лепкав тор, прилепнали надолу в района на клоаката, е отбелязан в същите дни като събирането на екскременти.

Колекция от чревно съдържание.

На 21-ия ден от експеримента 192 птици бяха евтаназирани с CO2 и възраждането бе предотвратено чрез дислокация на шийката на матката. След около 2 минути коремът беше отворен и различни части от стомашно-чревния тракт на пилетата бяха изрязани от 4 пилета на кошара. Събраното съдържание на жлезистия стомах, черва и цеца се замразява в течност N2 и се съхранява при -20 ° C.

Анализи на експериментални диети и съдържание на червата.

Тези анализи са извършени съгласно методите на Асоциацията на официалните аналитични химици (34) и са публикувани като допълнителни данни на уебсайта на PNAS, www.pnas.org.

Статистически анализи.

ANOVA се провежда чрез използване на процедурата за общите линейни модели на софтуера sas (35) и средствата за лечение са сравнени с най-малко значима разлика. Разликите се считат за значими при P d -глюкани, арабиноксилани и целулоза. Царевицата съдържа пентозани вместо (1,3–1,4) -β-глюкани. При диетата с ечемик значително повече фибри могат да бъдат извлечени с неутрален и киселинен детергент, отколкото при царевичната диета, а разликата се подчертава от добавянето на малц. Количеството топлоустойчива (1,3–1,4) -β-глюканаза в малца на трансгенната линия е 4,28 μg⋅g −1 разтворим протеин, което води до съдържание на 0,47 μg⋅g −1 разтворим протеин в диетата с ечемик с трансгенния малц. Не е открита термостабилна β-глюканаза в диетата, съдържаща малц Golden Promise.

Увеличаване на теглото, консумация на фураж, ефективност на фуража и сухо вещество на екскременти.

Добавянето на 6,2% трансгенен малц към диетата с ечемик осигурява наддаване на тегло, еквивалентно на използваната в момента царевична диета. TL, трансгенна линия; GP, Golden Promise.

Брой пилета с прилепнали лепкави отпадъци.

Анализ на броя на пилетата с лепкав тор, прилепили се надолу (фиг. 5, допълнителни данни) сред 60-те на дадена диета през пробния период е представен в диаграмата на фиг. 2. Само две пилета на диета с царевица имали лепкави изпражнения съответно на 14 и 17 ден. По време на диетата с ечемик между 15 и 17 пилета на диета имаха лепкави изпражнения, прилепнали към района на клоаката им по време на изпитването. Бонусите за пода потвърдиха обширните лепкави изпражнения от пилетата в кошарите, хранещи се с диета с ечемик. Наблюдава се значително намаляване на изпражненията, прилепнали към пуха, чрез допълване на диетата с ечемик с нормален ечемичен малц. Трансгенният ечемик за добавяне на малц намалява появата на лепкавия тор до честота 2: 7 сред 60-те пилета на тази диета в даден ден. По-нататъшното увеличаване на количеството добавен трансгенен малц вероятно ще елиминира напълно нежеланите изпражнения.

Брой пилета с полепнали лепкави изпражнения.

Съдържание на (1,3–1,4) -β-глюкани в диетите, малцовете и стомашно-чревния тракт.

Водоразтворими (100 ° C) и неразтворими (1,3–1,4) -β-глюкани в различни части на стомашно-чревния тракт и в екскрементите на пилета на диета с ечемик и на диета с добавен трансгенен малц, съдържащ термостабилен (1,3–1,4) -β-глюканаза.

Анализ на топлоустойчива (1,3–1,4) -α-глюканаза в стомашно-чревния тракт и екскременти.

Идентифициране на топлоустойчива (1,3–1,4) -β-глюканаза със специфични антитела в различни части на стомашно-чревния тракт и екскременти чрез Western blots. Ензимът, експресиран в Е. coli, не е гликозилиран (Mr = 24 000). Ензимът, експресиран в ечемика, е гликозилиран (Mr = 28 000) и следователно има по-ниска електрофоретична подвижност.

Вискозитет на дигеста в стомашно-чревния тракт.

Измерванията потвърждават, че диетата с ечемик води до по-висок вискозитет в стомаха и червата на жлезите, отколкото диетата с царевица (Таблица 2). Добавянето на ечемик или трансгенен малц намалява вискозитета в тези две части на храносмилателния тракт. Царевичната диета доведе до по-висок вискозитет на цекума в сравнение с диетата с ечемик и диетата с ечемик с добавка на нормален малц. Трансгенният малц увеличава вискозитета на цекума и към и над този, наблюдаван при диетата с царевица.

Вискозитет на съдържанието в храносмилателния тракт на пилетата, хранени с различни диети

Дискусия

Значителен извод може да се извлече от резултатите от настоящото изпитване с пилета. Възможно е да се въведе индивидуален рекомбинантен ензим в различни части на стомашно-чревния тракт на пилета с трансгенен малц и, по извод, трансгенно зряло зърно заедно с избраната диета. По този начин беше възможно да се определи колко рекомбинантна (1,3–1,4) -β-глюканаза се натрупва в активна форма в различните части на храносмилателния тракт и какъв ефект има върху метаболизма на (1,3–1, 4) -β-глюкани. Аналогично ще бъде възможно да се изследват ефектите на трансгенното зърно, експресиращо хибридния ензим, който съчетава каталитичната активност на термостабилна (1,3–1,4) -β-глюканаза с целулаза от Erwinia carotovora. Доказано е, че този мултиензим деполимеризира последователните (1,4) -β-свързани глюкозни единици, които са резултат от действието на (1,3-1,4) -β-глюканаза върху смесен свързан ечемичен β-глюкан (50) . Значението на арабиноксиланите в пилешките диети може да бъде подходящо изследвано с рекомбинантно експресирания хибриден ензим, съчетаващ активността на (1,3–1,4) -β-глюканаза с тази на (1,4) -β-ксиланаза (51).

Благодарности

Благодарим на г-н Франк Е. Хейги и д-р Х. Хорват за полезни съвети и морална подкрепа. С благодарност се отчита финансовата подкрепа от Вашингтонския технологичен център (грант № 99 B-1) и от Applied Phytologics, Сакраменто, Калифорния. Това е научна статия CSS 010906 от Колежа по земеделие и изследователски център за домашна икономика, Вашингтонски държавен университет, Pullman, WA.