• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Резюме

Въведение

Затлъстяването е водеща причина за няколко хронични заболявания и се превърна в глобален здравен проблем (1). Епидемиологичните проучвания показват положителна връзка между индекса на телесна маса (ИТМ) и честотата на различни видове рак, включително гърдата, яйчниците, дебелото черво и ендометриума (2). От тези видове рак ракът на ендометриума проявява най-силна връзка със затлъстяването. Ракът на ендометриума е най-често срещаният гинекологичен рак и приблизително 57% от случаите са свързани със затлъстяването в САЩ (3, 4). От различните подтипове, ендометриоидният рак на ендометриума (тип I) е хистологичният подтип, който е свързан предимно със затлъстяването с относителен риск от 1,59 (5). Въпреки значителното нарастване на честотата на рак на ендометриума при жени със затлъстяване през последните няколко десетилетия, са направени много ограничени лабораторни и клинични изследвания, за да се обърне внимание на ролята на висцералното затлъстяване (мастните депа в оментума и мезентерията на червата) при прогресията на рака на ендометриума. По този начин изясняването на молекулярните механизми, чрез които адипоцитите променят нормалната маточна функция и физиологията, е важно за разбирането на патологията на това заболяване.

mtor

Материали и методи

Клетъчни линии, антитела и реактиви

Клетъчна линия на човешки рак на ендометриума, Ishikawa (Sigma # 99040201) се култивира в MEM (HyClone), допълнена с 5% топлинно инактивиран FBS (Bovogen Biologicals), а миши ембрионални фибробластни мастни клетки (3T3-L1) се култивират в DMEM с висока глюкоза (HyClone), допълнена с 10% FBS. И двете клетъчни линии се поддържат в съответната среда за растеж, съдържаща 2 mmol/L 1 -глутамин (HyClone) и антибиотици (50 U/mL пеницилин, 50 mg/L стрептомицин; Gibco) при 37 ° C и 5% CO2. Аутентификацията на клетъчната линия беше оценена с помощта на метод за профилиране на ДНК с кратко повторение (STR) и замърсяването с микоплазма в клетките беше тествано на всеки 3 месеца.

Антителата, използвани в това проучване, са както следва: VEGF (Santa Cruz Biotechnology # sc-7269) за вестерн-блот, VEGF (R&D Systems # MAB293R) за имунохистохимия, VEGFR2 (CST # 9698), pVEGFR2 Tyr1175 (CST # 3770), CD31 ( Santa Cruz Biotechnology # sc-1506), Ki-67 (Abcam # ab15580), Foxa2 (DSHB # 4c7), Akt (CST # 4691), pAkt (CST # 4060), S6 (CST # 2317), pS6 (CST # 4858), ERα (Santa Cruz Biotechnology # sc-542), PR (Santa Cruz Biotechnoloby # sc-539), Stathmin (CST # D1Y5A), β-актин (DSHB # JLA20) и GAPDH (CST # 5174).

Реагентите, използвани в това проучване, са както следва: индометацин (Sigma # I7378), дексаметазон (Sigma # D1756), 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma # I5879), 3,3 ′, 5-трийодо-L-тиронин (Sigma # T2877), тип 1 колагеназа (Sigma # C5894), маслено червено O (Sigma # O0625), кристално виолетово (Sigma # C3886), тамоксифен (Sapphire Bioscience # 13258), DBL карбоплатин (Hospira # 611685A00) и ANZATAX Paclitaxel ( # 616841AAU).

Проби от човешка мастна тъкан

Комитетът по етика на университета в Нюкасъл одобри протокола за събиране на човешка мастна тъкан. Подкожната и висцералната мастна тъкан са събрани в среда DMEM/F-12 от пациенти с човешка жена (ИТМ> 30 kg/m 2), подложени на бариатрична хирургия за отслабване. Съгласието на пациентите беше получено съгласно одобрените насоки.

Изолиране на зрели адипоцити от човешката мастна тъкан

Първичните адипоцити са изолирани от човешката мастна тъкан (подкожна и висцерална), както е описано по-рано (15) с незначителни модификации. Накратко, мастната тъкан (приблизително 50–100 mg) се смила, измива с DPBS и се усвоява в разтвор на 1 mg/ml колагеназа (тип 1), съдържащ 0,5% BSA за 1 час при 37 ° C с леко разклащане. Сместа за смилане се прекарва през 45-μm клетъчно цедка (BD Biosciences) и се центрофугира при 800 rpm в продължение на 5 минути. Горният плаващ слой, съдържащ зрелите адипоцити, се събира, промива и култивира в DMEM/F-12. След 48 часа хранителната среда (500 μL), съдържаща първични адипоцити, се прекарва през спринцовъчен филтър (0,22 μm, Millipore) за събиране на подкожна и висцерална адипоцити, кондиционирана среда (SAT CM и VAT CM). Базална среда DMEM/F-12 като среда без серум (SFM) и 20% (v/v) от SAT CM или VAT CM в среда DMEM/F-12 са използвани в експеримента с клетъчна пролиферация.

Анализи на човешка проба от рак на ендометриума

Формалин-фиксиран парафин-вграден (FFPE) немобилна човешка ендометриална тъкан (n = 5) и ендометриална ракова тъкан от nonobese (n = 7) и затлъстели (n = 13) жени са получени от Hunter Cancer Biobank с одобрена институционална етика на човешките изследвания Протоколи на комитетите. Тканевите срезове бяха изрязани и оцветени за VEGF, VEGFR2, CD31 и pS6.

Експерименти с туморен ксенографт

Комитетът по грижа и етика на университета в Нюкасъл одобри всички процедури за експериментиране с мишки. Шест до 8-седмични женски NOD scid гама мишки (лабораторията Джаксън) бяха използвани за in vivo анализи на туморогенност. Клетките Ishikawa самостоятелно (1,5 × 106) или в комбинация с смляна човешка подкожна и висцерална мастна тъкан (150 μL обем на опаковани клетки, PCV) се инжектират подкожно с намален растежен фактор Matrigel (50 μL) във фланговете на мишките, както е описано по-рано (11). Обемите на тумора се измерват ежеседмично с помощта на цифрови апарати, използвайки формулата (дължина × ширина 2)/2. Теглото на тумора се определя в края на експеримента и се фиксира в 10% буфериран формалин, вграден в парафин и участъци, оцветени с антитела за анализ на туморната патология. Туморните секции също се замразяват бързо и се съхраняват при -80 ° C за изолиране на протеини и Western blot анализ.

Лечение с тамоксифен

Комитетът по грижа за животните и етика към университета в Нюкасъл одобри проучвания върху животни. Alms1 bbb/bbb и Alms1 bbb/+ Blobby мишки се инжектират интраперитонеално с носител (сусамово масло, 100 μL) или тамоксифен (100 μL от 20 mg/ml основна концентрация; 20 mg тамоксифен, разтворени в 1 ml сусамово масло чрез разклащане за една нощ при 37 ° C и се съхранява в светло блокиращ съд; n = 4/генотип за третиране). Леченията се повтарят три пъти с интервал от 48 часа между всяка инжекция. Мишките бяха евтаназирани 14 дни след първата инжекция. По време на дисекцията маточните тъкани бяха фиксирани в 10% буфериран формалин, вграден в парафин и секции, оцветени за хистологични анализи.

Диференциация на 3T3L1 фибробласти до адипоцити

3T3L1 фибробластите се диференцират в адипоцити, както е описано по-рано (13). Недиференцираните 3T3-L1 клетки (предварителни адипоцити) бяха отгледани до приблизително 95% етап на сливане (Ден 3) и индуцирани в DMEM с висока глюкоза, съдържаща 10% FBS, 1 mmol/L инсулин и 30 μmol/L T3 за 48 часа. След индукция, клетките се диференцират със 125 nmol/L индометацин, 2 μg/ml дексаметазон и 250 nmol/L метилизобутилксантин с промяна на средата на всеки 48 часа в продължение на допълнителни 7 дни. На 12-ия ден се наблюдават диференцирани 3T3-L1 клетки (адипоцити) с видими липидни капчици. За събиране на кондиционирана среда (СМ) от преадипоцити и диференцирани адипоцити, клетките се изплакват с DPBS и след това се излагат на базалната среда. След 24 часа средата се събира и центрофугира с помощта на центробежни филтри Amicon Ultra при 4000 об/мин за 30 минути при 4 ° С. Супернатантата се събира и съхранява при -80 ° С за клетъчна пролиферация, миграция и отговори на химиотерапевтични лекарства. Различни разтворими протеини, цитокини, хемокини и растежни фактори в СМ на култури от преадипоцити и адипоцити бяха идентифицирани с помощта на Mouse XL Cytokine Array Kit (R&D Systems), следвайки инструкциите на производителя.

Анализ на разпространението

Пет хиляди клетки бяха поставени в три екземпляра в 100 μL пълна среда на ямка от 96-многоплотни плоски дънни плочи (Corning Costar) и инкубирани в продължение на 24 часа при 37 ° C, 5% CO2, за да се прилепят клетките. След това клетките се третират с посочени концентрации на карбоплатин, паклитаксел и кондиционирана среда от адипоцити или мастна тъкан, последвано от допълнително инкубиране в продължение на 72 часа. В края на всеки инкубационен период клетъчната пролиферация и оцеляването се изследват чрез анализ на жизнеспособността на клетките Cell-Titer-Glo Luminescent (Promega) съгласно протокола на производителя.

Клоногенен анализ

Клетъчната преживяемост се оценява чрез засяване на 2000 клетки Ishikawa/ямка в 6-ямкова плака и се третира с 20% PACM и ACM веднъж на всеки 3 дни. На 10-ия ден клетките се фиксират в 70% алкохол и се оцветяват с 0,5% кристално виолетово. Група с повече от или равна на 50 клетки се счита за колония и се брои с помощта на софтуера ImageJ.

Анализ на миграцията на Transwell

Субконфлуентните клетки Ishikawa се култивират за една нощ в безсерумна среда (SFM). За анализ на миграцията 1 × 105 клетки в SFM бяха поставени в горната камера на вложките за анализ на Transwell (6.5 mm диаметър, 8 μm пори, Sigma # CLS3422), докато MEM SFM самостоятелно или съдържащ 20% PACM и ACM беше добавен към долната камера. След 24 часа инкубация при 37 ° С, мигриралите клетки се фиксират в 70% алкохол и се оцветяват с кристално виолетово (0,5%) за 10 минути. Клетките във вътрешната камера бяха изтрити механично с помощта на памучни тампони. Клетките, прикрепени към мембраната, бяха изобразени и количествено определени с помощта на софтуера ImageJ.

Имуноблот анализ

Протеините, които представляват интерес в човешката мастна тъкан и туморите на ксенотрансплантат на мишка, са определени чрез Western blot анализ, както е описано в предишното ни проучване (16). Накратко, мастната тъкан и туморите Ishikawa се промиват с PBS и се хомогенизират в ледено студен RIPA (радиоимунопреципитационен анализ) буфер, съдържащ протеаза и фосфатазни инхибитори (Sigma). Аликвотни части от тъканния хомогенат, съдържащи еднаква протеинова маса, се нагряват в 1X буфер за проба на Laemmli в продължение на 5 минути при 95 ° С. Пробите (30 μg протеин) се подлагат на SDS-PAGE (10% разделителен гел), прехвърлят се в нитроцелулозна попиваща мембрана (GE Healthcare Life Sciences) и се сондират с първично антитяло VEGF (1/500), pS6 (1/2,000), S6 (1/2 000), pAkt (1/1 500), Akt (1/1 500), VEGFR2 (1/1 000), pVEGFR2 Tyr1175 (1/1 000) за инкубация през нощта при 4 ° C. Мембраните бяха измити и инкубирани с вторични антитела, конюгирани с хрянова пероксидаза (Jackson ImmunoResearch Laboratories) за 1 час при стайна температура. Протеинът, който представлява интерес, беше направен видим чрез подобрена хемилуминесценция с помощта на луминесцентен анализатор на изображения LAS-4000 (FUJIFILM) и количествено определена чрез денситометрия с помощта на ImageJ (NIH, САЩ).

Имунохистохимия и имунофлуоресценция

Статистически анализ

Полученото от адипоцити VEGF-mTOR сигнализиране насърчава растежа на рак на ендометриума

За да потвърдим резултатите си от in vitro диференцирани адипоцити при пациенти с хора, ние изолирахме и култивирахме първични адипоцити от SAT и VAT с висок ИТМ (> 30 kg/m 2) пациенти от женски пол, които претърпяха бариатрична операция за отслабване (Фиг. 2А). Добавянето на човешки АСМ в концентрация от 20% (v/v) значително насърчава пролиферацията на ендометриални клетки при условия на серумен глад (фиг. 2В). Интересното е, че ДМ CM има по-висока тенденция да модулира разпространението на клетки на Ishikawa, отколкото от SAT CM. Разглеждайки тези констатации, ние оценихме дали адипоцитите влияят върху растежа на ендометриалните клетки в триизмерна среда (която в действителност имитира in vivo организацията на ендометриалните жлези; Фиг. 2С). Както се очакваше, клетките на Ishikawa от контролната култура имаха тенденция да образуват кръгли и сферични клъстери с централен лумен (фиг. 2Ca, b, b '). За сравнение, клетките Ishikawa, култивирани с VAT CM, показват тенденция към плеоморфизъм и морфологично тези органоиди на ендометриума имат по-големи клетъчни клъстери без определен лумен (Фиг. 2Cc, d, d 'и D).

Тъй като ДДС показва по-висока експресия на VEGF протеин и насърчава растежа на тумора, ние изследвахме дали VEGF-медиираната ангиогенеза поддържа растежа на тумора. Имунолокализацията на добре установен маркер на ендотелните клетки, CD31, върху тумори разкрива по-висок процент CD31-положителни кръвоносни съдове в туморите Ishikawa-VAT, отколкото при контролните и SAT туморите (Фиг. 2Jd-f и L). Също така открихме значителна положителна корелация между експресията на Ki-67- и CD31-позитивни съдове в туморите Ishikawa-VAT (Фиг. 2M; r = 0.892, P = 0.0421). Тези наблюдения предполагат значителния принос на ДДС за насърчаване на растежа на рак на ендометриума чрез VEGF.

Хиперфагични затлъстели мишки (Blobby) мишки прогресивно развиват ендометриална хиперплазия с хиперактивна VEGF-mTOR сигнализация

За да предоставим доказателства, че нарастващото увеличаване на теглото води до развитие на патологични промени в ендометриума, ние изследвахме матки от миши модел на синдром на Alstrom (рядко човешко генетично заболяване, което причинява хиперфагия, което води до тежко затлъстяване; справка 27). Подобно на хората, мишките с хомозиготна точкова мутация в гена Alms1 (Alms1: c.6507T> A) преяждат и развиват затлъстяване след пубертета на стандартна чау диета. Тези мишки се наричат ​​щам ‘Blobby’ (Alms1 bbb/bbb; Австралийски феномичен център). Нашите женски хомозиготни мишки Blobby (Alms1 bbb/bbb) постепенно натрупват телесно тегло спрямо хетерозиготни (Alms1 bbb/+) съплоди от 7-седмична възраст и наддаването на тегло нараства постепенно с възрастта (Фиг. 3А). На 20-седмична възраст мишките Blobby тежат средно 38 ± 2,3 g или натрупват почти 2-кратно телесно тегло в сравнение с хетерозиготни кученца, 22 ± 0,6 g (фиг. 3А и В). Това повишено телесно тегло е свързано с 11,4- ± 1,4-кратно увеличение на коремната AT маса, което се локализира в перитонеалната кухина и е прикрепено към матката (фиг. 3С и D). В съответствие с нашите наблюдения в модела за ксенотрансплантация на рак на ендометриума (фиг. 2J), мишките Blobby (Alms1 bbb/bbb) също имат значително повече кръвоносни съдове, свързващи AT с матката, в сравнение с хетерозиготи (Alms1 bbb/+; 48,7 ± 3,8 срещу . 14,7 ± 0,9; Фиг. 3D и E).

За да изследваме ефектите от прекомерното отлагане на мазнини в корема върху матката, събрахме матки от хомозиготни и хетерозиготни мишки Blobby. На 3-месечна възраст, когато телесното тегло на хомозиготни и хетерозиготни Blobby мишки не се различава значително, не са налице очевидни хистологични разлики в маточните секции на Alms1 bbb/bbb и Alms1 bbb/+ мишки (Фиг. 3F). Въпреки това, на 6-месечна възраст, когато хомозиготните Blobby мишки са имали значително наднормено тегло в сравнение с контролите, хистологичният и имунохистохимичният (Foxa2: жлезист маркер) анализ показва значително увеличение на броя на ендометриалните жлези в стромата, което е показателно за ендометриалната хиперплазия ( EH; ref. 28; Фиг. 3F и G; Допълнителна Фиг. S3; жлези на ендометриума: Alms1 bbb/bbb, 101.33 ± 2.6 срещу Alms1 bbb/+, 54.67 ± 4.1).

Яйчниковите хормони са основен регулатор на маточната функция и заболявания (30). За да определим дали стероидните хормони (естроген и прогестерон) имат някакъв ефект върху хиперпластичната матка на мишки Alms1 bbb/bbb, ние изследвахме експресията на естроген и прогестеронов рецептор (ERα и PR) и не открихме разлика в модела на експресия на тези два хормона рецептори между затлъстели и небъдни Blobby мишки (фиг. 3М). В обобщение, тези резултати показват, че прогресивното наддаване на тегло с повишено отлагане на мастна тъкан в корема води до патогенезата на ЕН при мишки с блоби, предшественик на рака на ендометриума.

Лечението с тамоксифен на затлъстели мишки Blobby води до развитие на ендометриален карцином in situ