Резюме

За да оценим в надлъжна настройка на връзката на нивата на Hb с антропометрични и метаболитни мерки, сравнихме размера на ефекта на тези асоциации при субекти от NFBC1966, които бяха изследвани за тях на възраст от 31 и 46 години (n = 3624). Както се очакваше, средните нива на Hb са останали непроменени от 31 до 46 години (разширени данни Фигура 3). По принцип размерите на ефектите на асоциациите се увеличават с възрастта или остават същите (фиг. 2б), като най-силно се наблюдава увеличението на асоциацията на нивата на Hb с нивата на триглицеридите и инсулина, HOMA-IR и съотношението на талията и тазобедрената става, съответно (фиг. 2в, таблици с разширени данни 6 и 7).

по-ниските

Размери на ефекта в SD единици на асоцииране на нивата на Hb със системни нива на метаболит в мета-анализ на произволни ефекти на NFBC1966 на възраст 46 години и YFS на средна възраст 42 години. Данните бяха коригирани за ИТМ, пол, тютюнопушене и физическа активност и коригирани за многократно тестване.

След това анализирахме в субпопулация на NFBC1966 19 асоциацията на нивата на Hb с консумацията на кислород в покой и намерихме доказателства за положителна асоциация на него и за тези на консумацията на кислород и процента на телесните мазнини и съответно нивата на Hb и телесните мазнини (Фиг. 4а, Разширени данни Фиг. 1 и Таблица 9). По този начин хората с по-ниски нива на Hb и по-малко мазнини консумират по-малко кислород.

За да се изследва причинно-следствената връзка на нивата на Hb върху ИТМ или ключовите метаболитни мерки, бяха извършени двупосочни MR анализи, използвайки европейската обобщена статистика на предците от проучвания за метаанализ в целия геном 7, 21 за тези променливи. Нито обратното претегляне на дисперсията (IVW), нито методът на регресия MR-Egger не дават съществени доказателства за причинно-следствена връзка по който и да е параметър в която и да е посока (Таблица 11 с разширени данни и Фигури 5 и 6). Въпреки това, в класическия MR, използващ геномни широконуклеотидни полиморфизми (SNP), инструментът е слаб. Следователно оптимизирахме инструмента на второ място и направихме анализи на полигенен риск, които разкриха доказателства за споделени генетични детерминанти между Hb и BMI и нивата на инсулин, триглицериди и HDL холестерол. Въпреки това, с наличните понастоящем набори от данни посоката на причинно-следствената връзка остава неясна и нейното разплитане почти сигурно ще изисква по-голям материал за изследване на асоциацията с широк геном Hb (Таблица с разширени данни 12). Поради това манипулирахме нивата на Hb в мишки C57Bl/6 чрез venesection и показахме, че за две седмици индуцираната еритропоеза повишава техните нива на Hb, което се свързва с повишено телесно тегло, инсулинова резистентност и нива на холестерол (Фиг. 4в, Разширени данни Фигура 7).

Онлайн съдържание

Методите, както и всички допълнителни елементи за показване на разширени данни са налични в онлайн версията на хартията; уникални препратки към тези раздели се появяват само в онлайн хартията.

Авторски приноси

P.K., J.A., J.K., J.T., R.S. и J.M. са проектирали анализите. В.К. извърши статистическите анализи. J.A., J.T., V.K., J.K., J.M., S.K.-K. и П.К. анализира данните. M.-R.J., J.A., S.K.-K., T.T., M.A.-K. и O.T.R. проектирани индивидуални проучвания. J.A., J.T., R.S., E.Y.D., J.K., T.T., M.A.-K., J.A. K.P., O.T.R., M.-R.J. и P.S. събрани и генерирани данни в отделни проучвания. P.K., M.-R.J., J.A., J.T., V.K., J.K., J.M. и S.K.-K. написа ръкописа.

Конкуриращи се финансови интереси

Авторите нямат конкуриращи се финансови интереси.

Методи

Проучване на популациите

Тествахме нашата хипотеза в две финландски популации, Кохорта за раждане в Северна Финландия 1966 (NFBC1966) 1, 2 и Сърдечно-съдов риск при изследване на младите финландци (YFS) 3. Първоначално NFBC1966 включва 12 068 майки, които са родили 12 231 живородени деца (96,3% от всички очаквани раждания в двете най-северни провинции на Финландия, Оулу и Лапландия, през 1966 г.). Събирането на данни започва през 1965 г., когато майките са били бременни и досега данните са събрани на възраст 1, 14, 31 и 46 години. На 31 и 46 години събирането на данни включва пощенски въпросници и клинични прегледи с антропометрични и измервания на кръвното налягане и вземане на кръвни проби (n = 3624 на 31 години и n = 5351 на 46 години, разширени данни Фиг. 1). Извършен е тест за максимално упражнение за субпопулация на 31-годишна възраст (n = 123).

Анализи на кръвта

Кръвните проби от NFBC1966 бяха взети след период на гладно през нощта, центрофугирани незабавно и преди анализирането на проби от 31 години бяха съхранявани първо при -20 ° C и по-късно при -80 ° C, докато проби от 46-годишни бяха анализирани незабавно, без да се съхраняват. Кръвни проби от NFBC1966 бяха анализирани в NordLab Oulu (предишното име на университетската болница в Оулу, лаборатория), лаборатория за изпитване (T113), акредитирана от Финландската служба за акредитация (FINAS) (EN ISO 15189). За анализи на кръвта на YFS вижте 3 .

Ниво на кръвен хемоглобин (Hb) и параметри на червените кръвни клетки

Параметрите на Hb в кръвта и червените кръвни клетки на NFBC1966 бяха определени с помощта на анализатор Coulter STKR (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) на възраст 31 години и анализатор Sysmex XE-2100 (Sysmex Corporation, Кобе, Япония) на възраст 46 години . Нивата на Hb в цялата кръв на NFBC1966 бяха определени с помощта на спектрофотометрични методи, червените кръвни клетки (RBC) бяха измерени с помощта на методи за откриване на електрическо съпротивление (импедансна технология) с хидродинамично фокусиране. На 31-годишна възраст хематокритът (HCT) се измерва чрез сумата на червените кръвни клетки, преброени в определен обем разредена кръв, а на възраст 46 години се определя HCT, като се използва определянето на височината на пулса на червените кръвни клетки.

Серумни липиди

Серумният холестерол (общ, HDL и LDL) и триглицеридите на NFBC1966 се определят с помощта на автоматичен анализатор Hitachi 911 и търговски реагенти (Roche, Boehringer Mannheim, Германия) на 31-годишна възраст 4, 5 и метод на ензимен анализ (Advia 1800; Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY, USA) на 46 години.

Високочувствителен С-реактивен протеин

Високочувствителният С-реактивен протеин (CRP) в NFBC1966 е анализиран чрез имуноензимометричен анализ (Medix Biochemica, Espoo, Финландия) на 31 години и чрез имунен нефелометричен анализ на 46 години (BN ProSpec, Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark, DE, САЩ).

Нива на глюкоза и инсулин и индекси на гладно

На 31-годишна възраст нивата на глюкоза на гладно и серумен инсулин на NFBC1966 се определят съответно по метода на глюкозната дехидрогеназа (Granutest 250, Diagnostica Merck, Дармщат, Германия) и чрез радиоимуноанализ (Pharmacia Diagnostics, Упсала, Швеция) При 46-годишни плазмени нива на глюкоза и серумен инсулин на NFBC1966 са анализирани чрез ензимен дехидрогеназен метод (Advia 1800, Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY, USA) и чрез хемилуминометричен имуноанализ (Advia Centaur XP, Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, Ню Йорк, САЩ), съответно.

За да оценим инсулиновата резистентност и функцията на β-клетките, изчислихме индексите на гладно HOMA-IR (плазмена глюкоза на гладно x серумен инсулин на гладно/22,5) и HOMA2-β ((20 x серумен инсулин на гладно)/(плазмена глюкоза на гладно - 3,5) x 100 ).

Тест за орален глюкозен толеранс и диабет

Извършен е двучасов орален тест за глюкозен толеранс (OGTT) след нощно (12-часово) гладуване за NFBC1966 на 46 години (n = 4446). Като критерии за изключване са използвани лекарства за диабет или непосредствено преди изследването, измерено ниво на капилярна глюкоза в кръвта> 8,0 mmol/l. Както серумният инсулин, така и плазмената глюкоза са измервани на изходно ниво и 30, 60 и 120 минути след прием на 75 g глюкоза. OGTT стойностите на глюкозата и инсулина бяха използвани за изчисляване на инсулина и площта на глюкозата под кривата (глюкоза-AUC и инсулин-AUC), индекс на Matsuda за инсулинова чувствителност (10 000 x ((глюкоза в плазмата на гладно x на гладно серумен инсулин) x ((глюкоза в плазмата на гладно) + 30 минути глюкоза в плазмата + 60 минути глюкоза в плазмата + 120 минути глюкоза в плазмата)/4) x ((серумен инсулин на гладно + 30 минути серумен инсулин + 60 минути серумен инсулин + 120 минути серумен инсулин)/4))) 6 .

Серумна метаболомика

Метаболитни измервания бяха получени с помощта на същата високопроизводителна серумна NMR метаболомична платформа в същата лаборатория за анализ, както е описано по-рано 7. Тази методология предоставя информация за 228 серумни мерки, включително разпределение на липопротеиновия подклас и концентрация на липопротеинови частици, метаболити с ниско молекулно тегло, като аминокиселини, 3-хидроксибутират и креатинин, и подробна молекулярна информация за серумните липиди. Данните за метаболитите, предоставени от тази платформа, са използвани в различни изследвания на епидемиологията и генетиката, които наскоро бяха прегледани 8. Методът осигурява метаболитни мерки в концентрационни единици, улесняващи интерпретацията и възпроизвеждането на находките.

Антропометрични измервания

Теглото и височината на тялото и обиколката на талията и ханша на участниците в NFBC1966 са измерени на 31 и 46 години. Теглото на тялото се измерва с цифрова скала, която се калибрира редовно. Височината се измерва два пъти (използва се средната стойност от двете измервания) с помощта на стандартен и калибриран стадиометър. И накрая, индексът на телесна маса (ИТМ) се изчислява като съотношението на тегло и височина на квадрат. Обиколката на талията и ханша беше измерена два пъти и беше използвана средната стойност от двете измервания. Съотношението талия-ханш се оценява като съотношение между обиколките на талията (на нивото по средата между най-ниския ръб на ребрата или гребена на илиака) и ханша (при най-широките трохантери). Освен това масата на телесните мазнини, процентът на мазнините, мускулната маса и висцералната мастна тъкан на участниците в NFBC1966 на 46-годишна възраст бяха измерени с анализатор на биоелектричен импеданс InBody 720 (Biospace Co., Ltd., Сеул, Корея). Всички антропометрични измервания са направени след една нощ (12 часа) на гладно. За YFS вижте 3 .

Измерване на кръвното налягане в брахията

В NFBC1966 брахиалното систолично и диастолично кръвно налягане е измерено два пъти на 31 години и три пъти на 46 години с интервал от 1 минута след 15 минути почивка на дясната ръка на седналите участници с помощта на автоматизирано устройство за осцилометрично кръвно налягане и маншет с подходящ размер (Меркуриен сфигмоманометър на 31 години и Omron Digital автоматичен апарат за кръвно налягане Модел M10-IT на 46 години). И накрая, средната стойност на две най-ниски систолни стойности и техните диастолични стойности беше използвана в анализите.

Объркватели и изключвания

Пушенето и физическата активност бяха използвани като объркващи. Участниците в NFBC1966 съобщават за навиците си за пушене на 31 и 46 години, а участниците ги категоризираме като никога, бивши и настоящи пушачи и в двата момента. Физическата активност беше проучена и категоризирана като неактивна, умерена или висока. Хората, използващи комбинирани орални контрацептиви, хормонозаместителна терапия или лекарства за понижаване на серумните липиди, са пропуснати от анализите на метаболомиката, тъй като е доказано, че те оказват значително влияние върху тези мерки (общо n = 957). Лица с известен диабет преди клинични прегледи са пропуснати от анализи. Диабетът е дефиниран според самоотчетените диагнози и лекарства, регистрите на амбулаторните и стационарни болници и регистрите на лекарствата от Института за социално осигуряване на Финландия. За YFS вижте 3 .

Анализи при мишки

статистически анализи

Антропометрични мерки

ИТМ е преобразуван в дневник, за да се елиминира изкривяването и хетероскедастичността в остатъците от модела. Височината беше включена като допълнителна обяснителна променлива в моделите на регресия, с изключение на модела за ИТМ. Анализите първо бяха проведени поотделно за проследяването на 46-годишна възраст в NFBC1966 и за YFS, а след това мета-анализирани за резултатите, налични и в двете кохорти, като се използва модел на претеглени случайни ефекти с обратна дисперсия. Размерите на ефекта на метаанализ са изчислени и отчетени в мерните единици, в които са измерени. За набора от данни NFBC1966 бяха проведени подобни модели на регресия за броя на червените кръвни клетки (Eryt) и хематокрита (Hct) вместо Hb, за да се изследва връзката между тези мерки и антропометричните променливи.

Метаболитни параметри

Нивата на инсулин на гладно, индексите Matsuda и HOMA, AUCs и нивата на тригицеридите и hsCRP бяха преобразувани в log, за да се осигури симетрия и хомосцедастичност на остатъците от модела. В променливата hsCRP, включително нули в стойностите, използваната трансформация е log (x + c/2), където c = min (xxΦ0), т.е. д. най-малката ненулева стойност в променливата. Анализите бяха проведени за 46-годишните последващи данни в NFBC1966 с включване и изключване на ИТМ като допълнителна обяснителна променлива.

ЯМР метаболомика

Общо бяха анализирани 150 метаболита от NMR метаболомичния панел (Таблица 8 с разширени данни). От тях 144 са измерени в концентрации и към тези променливи е приложена трансформация куб-корен 9. Останалите променливи бяха оставени нетрансформирани, с изключение на степента на ненаситеност, която имаше значително изкривено разпределение и по този начин лог трансформирана, за да осигури хомоскедастичност в остатъците на модела. Потребителите на комбинирани орални контрацептиви, хормонозаместителна терапия и лекарства за понижаване на липидите (общо n = 957) бяха пропуснати, тъй като тяхното влияние върху тези мерки 10,11. Анализите бяха проведени първо отделно в наборите от данни NFBC1966 (на 46 години) и YFS, а след това мета-анализирани с помощта на модели с обратна дисперсия, претеглени случайни ефекти. ИТМ е включен като допълнителна обяснителна променлива.

Надлъжни модели в NFBC1966

Удължени линейни модели, използващи генерализирани най-малки квадрати, бяха използвани за изследване на надлъжната промяна в асоциацията между нивата на Hb и резултатите, налични в две точки от времето в NFBC1966. Времето за измерване (на възраст от 31 години или 46 години) беше включено в модела като категорична променлива, а условията за взаимодействие с времето и всички други променливи (с изключение на пола и височината, където е приложимо) бяха включени в модела, за да позволят различни ефекти между кръстосването -секционни измервания. Условията за грешка бяха позволени да бъдат корелирани в рамките на всеки отделен и хетероскедастичен между времевите точки. Тези анализи бяха проведени с помощта на функцията gls (), налична в пакета nlme 12. Поради различните методи, използвани за измерване на hsCRP на 31 и 46 години, беше приложена обратна нормална трансформация на ранга, за да се зададат стойностите в сравним мащаб. Тъй като концентрациите на глюкоза при 31-годишното проследяване на NFBC1966 бяха измерени от пълноценна кръв, тези стойности бяха трансформирани до съответните концентрации в плазмата 13 за съвместимост с данните при 46-годишно проследяване.

Напречен и надлъжен анализ на нивата на Hb върху метаболитите

За да се анализират както напречното сечение, така и надлъжният ефект на нивата на Hb върху метаболитите, нивата на Hb се разлагат до средно ниво на Hb за всеки отделен j и вариране на Hb от индивидуалното средно ниво за всеки отделен j към момент от време k (1 = 31 години, 2 = 46 години). Следният модел е подходящ за всеки метаболит поотделно:

Този модел позволява едновременна оценка на напречното сечение (между субекта) ефект ßc и надлъжния (вътре субект) ефект ßL 14, като същевременно контролира потенциално вариращите във времето ковариации Zjk, в този случай ИТМ, пушенето и физическата активност. Членовете на грешките ∈jk бяха позволени да бъдат корелирани в рамките на всеки отделен и хетероскедастичен между времевите точки. Тези анализи бяха проведени с помощта на функцията gls (), налична в пакета nlme 2 .

Подпроба за максимален тест за упражнения в NFBC1966

Регресионни модели на ефектите от нивата на Hb върху консумацията на кислород в покой, разделени на височина (VO2rest/h), VO2rest/h върху процента на телесните мазнини и нивата на Hb върху процента на телесните мазнини бяха проведени за подгрупата на участниците в NFBC1966 на 31 години, които са претърпели тест за максимално упражнение с директно измерване на консумацията на кислород (M901, ергоспирометър, Medikro, Финландия) 15. Тези анализи включват секса като допълнителна обяснителна променлива.

Менделова рандомизация

Анализи за оценка на полигенен риск

Проведохме анализи на полигенен риск (PRS), за да проучим допълнително връзката между Hb, BMI и липиди. Ние генерирахме PRS за всички комбинации експозиция-резултат, използвайки резултатите от GWAS експозиция 23-26 за SNP тегла, оптимизирани за всеки резултат в NFBC1966 на 46 години. Използвахме PRSice софтуер 27 за изчисляване на PRS, като използвахме срязващо разстояние от 250kb и r 2 праг от 0,1. Десет първични генетични основни компонента бяха добавени като ковариати, за да се отчете стратификацията на популацията. PRS се изчислява за диапазон от гранични стойности на p-стойности (от 5 × 10 −8 до 1 на стъпки от 0,05) и ние докладваме PRS, използвайки гранична стойност на p-стойност, даваща най-висок R 2 с целевия резултат. Тъй като NFBC1966 е част от всички базови GWAS, използвани за изчисляване на PRS, може да очакваме известна инфлация в обяснения вариант на PRS. Като тест за чувствителност тествахме оптимизиране на PRS, използвайки резултатите от BMI GWAS от UKBiobank (http://www.nealelab.is/blog/2017/9/11/details-and-considerations-of-the-uk-biobank-gwas) на Hb в NFBC1966 на 46 години. R 2 за PRS, използвайки външните резултати от GWAS, е 0,35% (положителна асоциация, p = 4e-4), в сравнение с 0,17% (положителна асоциация, p = 0,01) с резултати от GWAS с включен NFBC1966, което не показва доказателства за инфлация в обяснението на дисперсията.

Анализ на обогатяване на генни набори

За да се изследва хипотезисната активация на пътя на реакция на хипоксия, беше извършен анализ на обогатяване на генетичен набор (GSEA) 28 за подгрупата на участниците в YFS на 34-49 години с нива на Hb и данни за профилиране на експресия на цяла кръв в генома (n = 1636) 29. Тестваният път на отговор на хипоксия включва 22 гена, индуцирани поне четири пъти от хипоксия в човешки моноцити (Разширени данни, Таблица 11) 30. GSEA се провежда между участници в YFS в най-ниския (Hb 152, n = 371) квартил на разпределението на Hb. Анализът е направен, адаптиран към възрастта, пола, ИТМ, YFS изследователския център, броя на левкоцитите и тромбоцитите, пет първи основни компонента на транскриптомичните данни и три технически променливи от хибридизации на микрочипове (чип, плака и кладенец). Анализът беше направен с остатъчни профили на генна експресия, изчислени чрез линейна регресия на всяка сонда за генна експресия и гореспоменатите променливи. Номинална стойност P 1. ↵