Парк Seon ‐ Ah

1 Център за неклинична оценка, Институт за биомедицински изследвания, Национална университетска болница Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

прах

Geum ‐ Hwa Lee

1 Център за неклинична оценка, Институт за биомедицински изследвания, Национална университетска болница Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

Hwa ‐ Young Lee

1 Център за неклинична оценка, Институт за биомедицински изследвания, Национална университетска болница Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

2 Катедра по фармакология и Институт за разработване на нови лекарства, Медицински факултет, Национален университет Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

The ‐ Hiep Hoang

1 Център за неклинична оценка, Институт за биомедицински изследвания, Национална университетска болница Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

2 Катедра по фармакология и Институт за разработване на нови лекарства, Медицински факултет, Национален университет Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

Хан-Юнг Чае

1 Център за неклинична оценка, Институт за биомедицински изследвания, Национална университетска болница Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

2 Катедра по фармакология и Институт за разработване на нови лекарства, Медицински факултет, Национален университет Chonbuk, Jeonju Chonbuk Южна Корея,

Свързани данни

Резюме

Това проучване е проведено, за да се изяснят антидиабетните ефекти на праха Gryllus bimaculatus, като се използва индуциран от стрептозотоцин (STZ) модел на плъх от диабет тип I. Прилагането на прах от насекоми значително е спасило представителни маркери за диабет (т.е. инсулин и С-пептид) при третирани със STZ плъхове. Наблюдавани са и резултати от подобрен тест за толерантност към глюкоза (GTT) и инсулинов толеранс (ITT), което показва, че прахът Gryllus bimaculatus има антидиабетни ефекти. Прилагането на прах от Gryllus bimaculatus е спасило индуцирани от STZ промени както в морфологията на островчетата, така и в моделите на оцветяване с инсулин. Екстрактът повишава експресията на антиапоптотичен Bcl2 и намалява експресията на проапоптотичен Bax и активна каспаза 3. В допълнение, добавката на прах Gryllus bimaculatus подобрява пътя на AKT/mTOR, ключов маркер за състоянието на анаболния метаболизъм, и неговия ефектор надолу по веригата, mTOR. Колективно нашите резултати показват, че Gryllus bimaculatus допринася за поддържането на функцията и морфологията на панкреаса β-клетки спрямо диабет чрез разпоредбите срещу апоптозата и анаболния метаболизъм.

Резюме

Това проучване предполага антидиабетните ефекти на праха от Gryllus bimaculatus в модел на плъхове, предизвикан от стрептозотоцин. Прахът от Gryllus bimaculatus подобрява състоянията на диабет по пътя на AKT/mTOR в стрептозотоцин-индуциран модел на животни с диабет. Това проучване предполага, че прахът от G. bimaculatus допринася за поддържането на функцията и морфологията на панкреаса на β-клетките в индуциран от стрептозотоцин модел на диабетни животни.

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Захарният диабет се отнася до група метаболитни нарушения, които включват заболявания, показващи повишени нива на кръвната захар в резултат на неадекватна секреция на инсулин или инсулинова резистентност (Novikova et al., 2013; van Belle, Coppieters, & Herrath, 2011). Диабет тип 1 (T1D) е хронично автоимунно заболяване, характеризиращо се със селективно автоимунно-медиирано унищожаване на β-клетки в панкреатичните островчета, което постепенно води до абсолютен дефицит на инсулин (Novikova et al., 2013; van Belle et al., 2011). Прилагането на инсулин през целия живот е необходимо за пациенти с T1D. За подпомагане на управлението на диабета и подобряване на качеството на живот и хранителния баланс на пациентите с T1D се препоръчват функционални храни, базирани на храненето.

Индуциран от стрептозотоцин (STZ) модел на животни е предложен като подходящ метод за изследване на ефикасността на храни, които могат да подобрят T1D (Deeds et al., 2011; Shen et al., 2012; Zhang et al., 2014). STZ е глюкозамин-нитрозоурейно съединение, което попада в β-клетките на панкреаса чрез окисление, което води до образуването на супероксидни радикали; в резултат на това се произвеждат водороден пероксид и хидроксилни радикали (Eleazu, Eleazu, Chukwuma, & Essien, 2013; Lenzen, 2008), а STZ инхибира активността на аконитазата и причинява отделянето на токсични азотни оксиди, които увреждат ДНК. Най-важното е, че токсичността на STZ води до панкреатична β-клетъчна некроза (Lenzen, 2008; Sakuraba et al., 2002).

Сред изключително хранителните функционални източници на храна насекоми като щурци са класирани на 4-то място в световен мащаб. Ефективността на производството на крикет е относително висока (80%) в сравнение с говеждото месо (40%), свинското месо (55%) и домашните птици (55%). Освен това насекомите се появяват като алтернатива на животинския протеин (Kouřimská & Adámková, 2016). Ahn et al. (2005) съобщават, че щурецът Gryllus bimaculatus съдържа ненаситени мастни киселини, които могат да се използват както като храна, така и като лек за треска, диария, камъни в бъбреците и хипертония. В допълнение, докладите предполагат, че етаноловият екстракт от Gryllus bimaculatus не е токсичен за хората (Lee et al., 2016; Ryu et al., 2016). Следователно, това проучване е проведено, за да се определи дали приемът на прах от Gryllus bimaculatus може да допринесе за възстановяването на функцията на панкреатичната клетка и свързаното с нея антидиабетно състояние в индуциран от STZ модел на плъх на T1D.

2. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1. Материали

STZ, глюкоза, инсулин и разтвор на хематоксилин и еозин Y са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, МО, САЩ). Комплект С-пептид ELISA е закупен от BioVision (Eugene, OR, USA). Комплект ELISA за инсулин за плъх/мишка е закупен от Merck Millipore (EMD Millipore, Дармщат, Германия). За имуноблотинг, антитела срещу β-актин, p-AKT и Bax са закупени от Santa Cruz Biotechnology (Санта Круз, Калифорния, САЩ). AKT, p-AKT, p-p70S6K, 4EBP1, p-4EBP1, mTOR, p-mTOR, Bcl2, инсулин и разцепена каспаза 3 са закупени от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Търговска марка прах Gryllus bimaculatus под името „D&D (Diabetes & Dietary, Inventor: Dr Lee Sam Goo, South Korea)“ е получена от 239bio Inc. (Ixsan, Chonbuk, Южна Корея). За да се създаде прахът, периодът на растеж на Gryllus bimaculatus е ограничен до максимум 35 дни. Щурците бяха подложени на 3-дневен период на дефекация, измити три пъти в дестилирана вода и след това лиофилизирани. Изсушеният чрез замразяване Gryllus bimaculatus се хомогенизира и прахът се съхранява при -20 ° C в продължение на 4 седмици. Производството на прах се основава на патенти, принадлежащи на 239bio Inc., Корея, със следните регистрационни номера: 10–1686179, 10–1663202, 10–1702851, 10–1716766, 10–1716763, 10–1773851 и 10–1809451).

2.2. Животни

Осемседмични мъжки SD плъхове са закупени от Saeron Bio Inc. (Uiwang-si, Gyeonggi-do, Корея). Всички животни бяха настанени при 18-25 ° C в рамките на 12-часов цикъл светлина/тъмнина и им беше разрешен достъп ad libitum до храна и вода. След 1 седмица на аклиматизация, плъховете се инжектират интраперитонеално (IP) с единична доза прясно приготвен STZ (65 mg/kg, Sigma-Aldrich; 0,05 М цитратен буфер; рН 4,5), за да се индуцира T1D. Контролната група се инжектира с еднакъв обем, съдържащ само цитратен буфер. Диабетът е потвърден 7 дни след инжектирането чрез измерване на нивата на кръвната глюкоза с глюкометър Accu-Chek (Roche, Бостън, Масачузетс, САЩ). Нивата на кръвната глюкоза се измерват веднъж седмично в деня преди приложението на прах от Gryllus bimaculatus (Ryu et al., 2016). Контролната група е хранена само с най-високата доза (6.5 g/kg) прах Gryllus bimaculatus, докато групата с диабет е хранена с различни дози (1.63, 3.25 и 6.5 g/kg) два пъти дневно (10:30 и 16:00) ). Контролната група се хранеше с еднакъв обем вода.

2.3. Измервания на кръвната захар, интраперитонеални тестове за толерантност към глюкоза и тестове за толерантност към инсулин

Измерванията на кръвната захар, интраперитонеалните тестове за толерантност към глюкоза (GTT) и инсулиновите толерантности (ITT) бяха извършени, както е описано по-рано (Cho, Zhou, Sheng и Rui, 2011). Накратко, нивата на кръвната глюкоза се измерват ежеседмично в кръвни проби от опашка на плъх, започвайки с перорално приложение на прах Gryllus bimaculatus. GTT се извършват 2 дни преди евтаназия и анализите се извършват в 09:00 след 12 часа на гладно (храната е изтеглена в 21:00 предишната вечер). 10% разтвор на глюкоза (1 g/kg) се дава като болус IP инжекция и кръвни проби се събират на 0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути след прилагане за определяне на нивата на глюкоза в кръвта. Подобна процедура беше извършена за ITTs в 08:00 след 4 часа на гладно (храната беше изтеглена в 04:00). Инсулин (0,75 U/kg) се прилага като болусна IP инжекция и нивата на кръвната глюкоза се определят на 0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути след инжектирането.

2.4. Имунохистохимично оцветяване

Извършено е имунохистохимично оцветяване, както е описано по-рано (Chau et al., 2017; Franko et al., 2016; Song et al., 2010). За анализа, панкреасите от плъхове бяха фиксирани в 3,7% разтвор на формалдехид, дехидратирани в степенувана етанолова серия, вградени в парафин (Leica, Wetzlar, Германия), и разделени на 4 µm филийки. За H&E оцветяване на панкреаса, срезовете първо се оцветяват с хематоксилин за 2 минути и след това с еозин (Sigma-Aldrich) в продължение на 5 минути след 10-минутно измиване. За оцветяване на инсулин в панкреасните островчета секции бяха инкубирани с инсулиново антитяло (1: 100, Santa Cruz Biotechnology). Експресията на инсулин се открива с 3-амино-9-етилкарбазол (AEC; Dako, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и след това ядрото се оцветява с хематоксилин.

2.5. Имуноблотинг

Общият протеин се екстрахира от панкреаса с помощта на лизисен буфер (150 mM NaCl, 0,5 M Tris-HCl, 2,5% дезоксихолова киселина, 10% NP-40 и 10 mM EDTA; рН 7,4). Пробите се разделят с 10% -13% натриев додецил сулфат (SDS) -полиакриламиден гел електрофореза (PAGE) и се прехвърлят в PVDF мембрани (Bio-Rad). Мембраните бяха инкубирани със специфичните първични антитела (Bax, Bcl2, AKT, p-AKT, p70S6 киназа, p-p70S6 киназа, 4EBP1, p-4EBP1, mTOR, p-mTOR, разцепена каспаза 3 и β-актин, 1: 1000 до 1: 2000) през нощта при 4 ° C, последвано от инкубация с конюгирано вторично антитяло от хрян пероксидаза-IgG в продължение на 1 час при стайна температура. Сигналите са визуализирани с помощта на рентгенов филм (GE Healthcare, Amersham, Buckinghamshire, UK). Експресията на протеин беше анализирана с помощта на софтуер за откриване на ленти в ImageJ (NIH, MD, САЩ).

2.6. Статистически анализ

Всички стойности са изразени като средни стойности ± SEM. За всички групи беше използван t тест. Статистическите изчисления, начертаване и напасване на кривата бяха извършени с помощта на Origin 7.0 (OriginLab Co., Масачузетс, САЩ). Стойност P (Фигура 1а). 1 а). Маркерите на T1D, включително серумните нива на C-пептид и инсулин, са значително намалени в индуцираната от STZ група за диабет в сравнение с недиабетната група (Фигура (Фигура 1b, c). 1 b, c). Групата, третирана с прах Gryllus bimaculatus, представи дозозависимо спасяване на нивата на тези маркери, показвайки, че прахът Gryllus bimaculatus има понижаващ глюкозата ефект в модела на плъхове T1D.

3.2. Ефекти на прах Gryllus bimaculatus върху състоянията на толерантност към глюкоза и инсулин

Нарушеният глюкозен толеранс (IGT) е преддиабетно състояние на хипергликемия, което е свързано с инсулинова резистентност. През последната седмица на експеримента беше извършен тест за глюкозен толеранс на плъхове, за да се оцени инсулиновата чувствителност. Както е показано на Фигура Фигура 2а, 2а, глюкозният толеранс е бил нарушен в индуцираната от STZ група за диабет, но това увреждане е било значително спасено в групата, третирана с прах от Gryllus bimaculatus. За да се определи чувствителността към инсулин в присъствието на прах Gryllus bimaculatus, към модела беше приложено отделно тест за толерантност към инсулин. Както се очаква, лечението с прах Gryllus bimaculatus повишава инсулиновата чувствителност в индуцирания от STZ модел на диабет (Фигура (Фигура2 2 b).

3.3. Ефекти на прах Gryllus bimaculatus върху функцията и морфологията на панкреаса

Бяха изследвани хистопатологични промени в панкреатичните тъкани на плъховете, за да се потвърди ефектът на праха Gryllus bimaculatus върху функцията и морфологията на панкреаса. Дегенеративни и некротични промени, както и свиване на островчетата Лангерханс, са наблюдавани в хистологични разрези на панкреатични тъкани от индуцираната от STZ група за диабет (Фигура (Фигура 3а, 3а, отгоре). Прахът Gryllus bimaculatus обаче подобрява това увреждане, особено при най-високата доза (6,5 g/kg), и предизвика ясно възстановяване в индуцираната от STZ група за диабет.Освен това, при имунохистохимично оцветяване на тъканите на панкреаса, ясно се наблюдава зависимо от дозата прахообразно намаление на експресията на инсулин (Фигура (Фигура 3а, 3 а, отдолу). Интензивността на оцветяването с инсулин е количествено определена (Фигура (Фигура 3b) 3 b) и се предполага, че прахът от Gryllus bimaculatus е запазил функцията на панкреаса β-клетки и поддържа панкреатичната структура.

3.4. Ефекти на прах от Gryllus bimaculatus върху увреждане на панкреаса в резултат на индуциран от STZ диабет

Изследвахме как прахът Gryllus bimaculatus регулира репликацията на β-клетки и оцеляването при индуциран от STZ диабет. За да се изследва ефекта на прах от Gryllus bimaculatus върху пътя на апоптоза в панкреаса, беше извършено имуноблотиране, за да се потвърди експресията на проапоптотичните Bax и антиапоптотичните Bcl2 протеини (Yoo & Park, 2018; Zhang et al., 2014). Третирането с прах от Gryllus bimaculatus води до повишена експресия на Bcl2, намалена експресия на BAX и инхибиране на разцепването на каспаза 3 в индуцираната от STZ група за диабет (Фигура (Фигура 4а). 4а). Количественият анализ показа антиапоптотичната роля на праха от Gryllus bimaculatus при панкреаси от индуцираните от STZ групи за диабет (Фигура (Фигура 4b-d). 4 b – d). Тези открития предполагат, че ефектите на праха Gryllus bimaculatus върху панкреатичната функция и морфологичните промени са добре корелирани с модела на експресия на анти- и проапоптотичен протеин.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЯ

В това проучване се предполага, че прахът от Gryllus bimaculatus има някои благоприятни ефекти срещу T1D, както се вижда от резултатите от индуциран от стрептозотоцин (STZ) модел на диабетни плъхове. Прилагането на този екстракт от насекоми значително е спасило намалените C-пептидни и инсулинови реакции, открити при диабетични състояния. Освен това антиапоптотичният протеин Bcl2 и проапоптотичните протеини Bax и разцепената каспаза 3 се възстановяват до контролно ниво по зависим от дозата начин. Прахът Gryllus bimaculatus регулира mTORC1, главен контролер на чувствителността на хранителни вещества и клетъчния растеж, който ние предлагаме като механизъм, включен в индуцирания от праха Gryllus bimaculatus ефект на понижаване на глюкозата в този модел. В това проучване се препоръчва прах от Gryllus bimaculatus да бъде ефективна естествена функционална храна, която проявява понижаващ глюкозата ефект при индуцирано от STZ диабетно състояние.

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

ЕТИЧНО ОДОБРЕНИЕ

Всички процедури с животни са проведени в съответствие с Принципите на лабораторните грижи за животните на Асоциацията за оценка и акредитация на Laboratory Animal Care International (AAALAC) на Националната университетска болница Чонбук (номер на одобрение: cuh-IACUC-2017-21) и са акредитирани от AAALAC на 8 ноември 2017 г. (cuh ‑ IACUC ‐ 170316–6).

Подкрепяща информация

ПРИЗНАНИЕ

Това проучване беше подкрепено от съвместната програма за научноизследователска и развойна дейност (2017) на Агенцията за националния клъстер на храните (AnFC), Република Корея.

Бележки

Парк S-A, Lee G-H, Lee H-Y, Hoang T-H, Chae H-J. Понижаващ глюкозата ефект на прах Gryllus bimaculatus върху индуциран от стрептозотоцин диабет по пътя на AKT/mTOR. Food Sci Nutr. 2020; 8: 402–409. 10.1002/fsn3.1323 [CrossRef] [Google Scholar]

Информация за финансиране

Това проучване беше подкрепено от съвместната програма за научноизследователска и развойна дейност (2017) на Агенцията за Корейския национален хранителен клъстер (AnFC), Корея.