Департамент по хранителни науки и хранене на човека, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо

Департамент по хранителни науки и хранене на човека, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо

Департамент по хранителни науки и хранене на човека, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо

Департамент по хранителни науки и хранене на човека, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо

Департамент по хранителни науки и хранене на човека, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо

Департамент по хранителни науки и хранене на човека, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо

Департамент по хранителни науки и хранене на човека, Държавен университет в Колорадо, Форт Колинс, Колорадо

Адрес за заявки за повторно отпечатване и друга кореспонденция: C. L. Gentile, Катедра по наука за храните и храненето на човека, Университет на Колорадо, Форт Колинс, CO 80524 (имейл: [имейл защитен]).

Резюме

Характеризиране на микробиота.

Фекален материал се събира при прекратяване и ДНК се екстрахира с помощта на PureLink Microbiome DNA Purification Kit (A29790, Invitrogen, Carlsbad, CA). Използвана е количествена PCR, за да се провери потискането на микробиотата при третирани с Abx животни. Реакциите бяха оптимизирани за 16s rRNA гена, използвайки универсални бактериални праймери (напред 5′-AAACTCAAAKGAATTGACGG-3 ′, обратен 5′-CTCACRRCACGAGCTGA-3 ′) (2). Условията за колоездене при използване на термоциклер Bio-Rad CFX96 са както следва: 95 ° C за 3 минути и след това 40 цикъла от 95 ° C 15 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C 10 s, 85 ° C 5 s, последвани от откриване на флуоресценция.

Библиотеките за секвениране на сдвоени краища са конструирани, следвайки протокола Illumina 16s, който включва усилване на V3-V4 регионите на 16s rRNA гена, пречистване на ампликони с помощта на AmPure мъниста, лигиране с адаптери Illumina и двойни индекси, последвано от друг кръг на топчета AmPure пречистване, количествено определяне, денатурация и обединяване на библиотеки и последователност на Illumina MiSeq. Сдвоените fastq файлове бяха събрани и обработени с помощта на myPhyloDB версията по подразбиране. 1.2.0 тръбопровод за секвениране (45), който използва софтуера за биоинформатика mothur за обработка на последователности (57). Накратко, последователностите бяха скринирани (maxhomop = 0, maxambig = 1), химерите бяха премахнати и класифицирани към най-близкия съсед, базиран на K-mer (KNN) в версията на GreenGenes. 13_5 референтна база данни. След приключване на обработката данните се нормализират чрез разреждане въз основа на минимален размер на извадката от 165 872 четения. Бяха проведени петстотин независими цикъла за нормализиране и средното изобилие за всички цикли за нормализиране беше използвано при по-нататъшни анализи.

Циркулиращи аналити.

Плазмените нива на инсулин, лептин и възпалителни цитокини интерлевкин-6 (IL-6), моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) и плазминогенен активатор инхибитор-1 (PAI-1) бяха определени с помощта на мултиплекс анализ (MADKMAG- 71K, EMD Millipore, Billerica, MA). Вътреаналитична вариабилност (3 (UVP, Upland, CA) системи за изображения, съответно. Експресията на всеки целеви протеин се нормализира до GAPDH (1: 1000, № 2118, CST), съотношението на фосфорилирания/общия протеин, изчислено за всяка проба, а данните се представят като промяна в пъти спрямо SD.

Тест за толерантност към глюкоза.

В месец 5 на диета и 1 седмица преди прекратяване на експеримента, мишките бяха на гладно в продължение на 6 часа и кръвната глюкоза се определяше от кръвта на опашната вена, използвайки глюкомери AlphaTRAK 2 (Abbott Laboratories, Chicago, IL). Мишките получиха интраперитонеална инжекция от 2 g/kg декстроза и кръвната глюкоза беше оценена на 0, 15, 30, 60 и 120 минути след инжектирането.

Статистика.

Данните са изразени като средни стойности ± SE. Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен ANOVA с post hoc тест на Tukey (SPSS за Windows, версия 11.5.0; SPSS, Чикаго, Илинойс). За кривите на aPWV и EDD и EID доза-отговор се използва смесен модел ANOVA (в рамките на фактор, време или доза; между фактор, група на лечение). Когато се наблюдава значителен основен ефект, се извършва post hoc тест на Tukey, за да се определят конкретни двойни разлики. A P стойност на

обръща

Фиг. 1.Лечението с антибиотици потиска чревната микробиота вследствие на дисбиоза, предизвикана от западната диета. A: промени в общия брой на бактериите след стандартна диета (SD), западна диета (WD) и WD с лечение с антибиотик (Abx). Б.: цекална маса след WD и антибиотично лечение. ° С: анализ на главния компонент (PCA) на мишки на фекални микробни съобщества, оцветени с диета (затворени кръгове = WD; отворени кръгове = SD) и показващи вариабилност на бактериалните видове във всеки квадрант. д: хистограма на значително диференциално обилни бактериални таксони в WD спрямо SD (q = 0,05), представена като промяна на дневника. Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен ANOVA с post hoc тест на Tukey. Данните са изразени като средни стойности ± SE; н = 10–12/група. *P

Западната диета води до значителни промени в чревната микробиота. Например, спрямо SD, животните на WD показват значително увеличени Firmicutes (SD = 49,755; WD = 109,454; P = 0,0002) и намалени Bacteroidetes (SD = 21,907; WD = 11,205; P = 0,016) и актинобактерии (SD = 94,082; WD = 45,210; P = 0,003). Анализът на PCA показа клъстериране на проби по тип диета по PC1, с разделяне, обусловено от Ruminococcus gnavus за WD и няколко Bifidobacterium spp. за SD (фиг. 1° С). Изобилието от многобройни бактериални таксони бяха променени от диетата; по-специално, Bifidobacterium spp. са били значително по-богати на SD животни в сравнение с WD (Фиг. 1д).

Артериалната скованост прогресивно се увеличава при WD мишки по време на 7-месечната интервенция. При мишки, хранени с WD, които са получили антибиотично лечение (WD + Abx), артериалната скованост е напълно нормализирана до нивата на SD (Фиг. 2A). По същия начин дебелината на аортната среда беше увеличена при WD в сравнение със SD мишки и нормализирана при WD + Abx (Фиг. 2Б.). Не са наблюдавани групови разлики за пасивен луминален диаметър (SD 161,7 ± 7,4, WD 170,8 ± 6,7, WD + Abx 174,9 ± 8,5 µm) или предизвикано от фенилефрин предварително свиване (SD 56,6 ± 5,5, WD 59,0 ± 4,3, WD + Abx 59,9 ± 4,4) %) в изолирани мезентериални артерии. Подобно на артериалната скованост, ендотел-зависимата дилатация (EDD) беше значително нарушена при WD мишки и антибиотичното лечение обърна тази дисфункция (Фиг. 3, A и Б.). Инхибирането на синтазата на азотен оксид с l -NAME намалява EDD във всички групи, така че максималното медиирано от ацетилхолин дилатация е сходно във всички групи (Фиг. 3° С). l -NAME-инхибираната дилатация беше намалена при WD мишки и възстановена с антибиотично лечение (Фиг. 3д). Независимата от ендотел дилатация не е променена от диета или антибиотично лечение (Фиг. 3, Е. и F).

Фиг. 2.Антибиотиците обръщат индуцирана от диетата артериална скованост. A: артериалната скованост се измерва последователно чрез in vivo скорост на аортна импулсна вълна (aPWV). Лечението с антибиотици при подгрупа от WD мишки е започнало след 5 месеца WD хранене, както е посочено. Б.: дебелината на средата беше определена в сегменти на проксималната гръдна аорта. Статистическият анализ беше извършен с използване на многократни ANOVA (aPWV) и еднопосочен ANOVA (дебелина на средата) с post hoc тест на Tukey. Данните са изразени като средни стойности ± SEM; н = 10–12/група. *P


Фиг. 3.Антибиотиците преодоляват ендотелната дисфункция, предизвикана от западната диета, и възстановяват дилатацията, инхибирана от l -NAME. Зависима от ендотел дилатация (EDD) само до ацетилхолин (ACh) (A и Б.) и в присъствието на инхибитор на азотен оксид синтаза l -NAME (° С) се определя в мезентериалните артерии. д: l -NAME-инхибираната дилатация, мярка за NO-зависима дилатация, беше изчислена като процентно намаление на максималното EDD в отсъствие спрямо присъствието на l -NAME. Е. и F: ендотел-зависима дилатация (EID) до натриев нитропрусид (SNP). Статистическият анализ беше извършен с използване на ANOVA с повтарящи се мерки (отговори на дозата на EDD и EID) и еднопосочен ANOVA (всички други резултати). Когато се наблюдава значителен основен ефект, се извършва post hoc тест на Tukey, за да се определят конкретни двойни разлики. Данните са изразени като средни стойности ± SE; н = 8–12/група. *P

Телесното тегло, както и масите на епидидима и подкожната мастна тъкан са значително увеличени от WD и не са засегнати от антибиотично лечение (Фиг. 4, A-° С). Плазмените нива на лептин и инсулин също са били повишени при WD и не са значително намалени при антибиотично лечение (Фиг. 4, д и Е.). По същия начин WD значително нарушава толерантността към глюкозата, без ефект на антибиотично лечение (Фиг. 4F).

Фиг. 4.Лечението с антибиотици не променя телесния състав или глюкозния толеранс. Телесно тегло (A), епидидимална мастна маса (Б.), и подкожната мастна маса (° С) след хранене с WD и антибиотично лечение. Плазмен лептин (д) и инсулин (Е.) бяха определени чрез мултиплекс ELISA. F: площ под кривата (AUC) за ip тест за толерантност към глюкоза (GTT). Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен ANOVA с post hoc тест на Tukey. Данните са изразени като средни стойности ± SE; н = 10–12/група. *P

За да започнем да изследваме потенциалните механизми, чрез които потискането на чревната дисбиоза обръща съдова дисфункция, ние оценихме плазмените нива на LPS-свързващ протеин (LBP) и разтворим клъстер на диференциация-14 (sCD14), два маркера на LPS сигнализиране, свързани със сърдечно-съдови резултати (35 ). LBP (фиг. 5A) и съотношението LBP: sCD-14 (Фиг. 5Б.) са били увеличени в WD и значително намалени в WD + Abx. В светлината на тези данни, след това измерихме плазмените нива на няколко провъзпалителни медиатори, индуцирани от LPS. IL-6 и PAI-1 са значително увеличени при WD, но не и WD + Abx; като има предвид, че MCP-1 е значително намален в WD + Abx (фиг. 5, ° С-Е.). За по-нататъшно изследване на потенциалните механизми, допринасящи за съдова дисфункция, ние изследвахме експресията на протеини в аортата и околния PVAT. Фосфорилирането на NF-кВ, което също се случва след LPS сигнализирането, е значително увеличено в аортата на WD мишки и се нормализира след антибиотично лечение (Фиг. 6A). Експресията на PVAT на p67phox, регулаторна субединица на NADPH оксидаза (NOX) 2, се увеличава при WD, но не и WD + Abx, в сравнение с контролно хранени мишки (фиг. 6Б.). За разлика от това, експресията на PVAT NOX4 не се различава между групите (Фиг. 6° С). И накрая, възрастта на PVAT обикновено е по-висока в WD (P = 0,053 срещу SD) и са значително намалени при WD + Abx в сравнение с WD (Фиг. 6д).

Фиг. 5.Лечението с антибиотици отслабва индуцираното от западната диета увеличение на циркулиращите маркери на ендотоксемия и възпаление. Циркулиращ LBP (A), LBP/sCD14 (Б.), IL-6 (° С), PAI-1 (д) и MCP-1 (Е.) се определят в плазма чрез ELISA. Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен ANOVA с post hoc тест на Tukey. Данните са изразени като средни стойности ± SE; н = 5–12/група. *P


Фиг. 6.Лечението с антибиотици отслабва предизвиканото от диетата увеличение на протеините, свързани с възпаление и оксидативен стрес. A: съотношението на фосфорилирания към общия NF-кВ се определя в аортата чрез Western blotting. Изобилие от NADPH оксидаза (NOX) 2 субединица p67phox (Б.), NOX4 (° С), както и усъвършенствани крайни продукти за гликиране (AGE) (д) бяха определени в периваскуларна мастна тъкан (PVAT) чрез Western blotting. Експресията на GAPDH се използва за отчитане на разликите в натоварването с протеини. Представителни петна са показани под всяка графика. Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен ANOVA с post hoc тест на Tukey. Данните са изразени като средни стойности ± SE; н = 7–12/група. *P

И накрая, проведохме няколко корелационни анализа, за да дадем представа за връзките между промените в бактериалните видове, възпалението и съдовата функция. Няколко бактериални вида са свързани с първичните резултати; по-специално три щама на Бифидобактерии са в обратна корелация с телесното тегло, LBP и съдовата функция (вж. допълнителна фигура 1A, наличен с онлайн версията на тази статия и таблица 1). Освен това, LBP е в значителна корелация и с двата индекса на съдовата функция, l -NAME-инхибираната дилатация, както със системното, така и със съдовото възпаление (Допълнителна фиг. 1, Б.-Е.). Колективно тези резултати подпомагат поредица от събития, при които WD-индуцираните намаления в Бифидобактерии увеличават LPS транслокацията и системната сигнализация, което от своя страна разпространява възпалителен отговор, който води до съдова дисфункция.

Таблица 1. Съотношения между бактериалното изобилие и физиологичните резултати при стандартни и западни мишки, хранени с диета

За корелации са използвани смесени данни от групите със стандартна диета (SD) и западна диета (WD). Б., Bifidobacterium; EDD, ендотел-зависима дилатация; aPWV, скорост на аортната импулсна вълна; LBP, LPS свързващ протеин; BW, телесно тегло. н = 9–12/група.

* P l-ИМЕ-инхибира дилатация. И накрая, индуцираната от диетата съдова дисфункция корелира с намаляването на няколко бактериални таксона, най-вече няколко вида Bifidobacterium. Като цяло тези резултати показват, че чревната дисбиоза може да бъде причинен фактор за развитието на съдова дисфункция и предполагат потенциална роля на LPS, получена от бактерии, при медиирането на тези събития. Тези резултати разширяват последните данни, свързващи чревната дисбиоза с развитието на други сърдечно-съдови аномалии, включително атеросклероза и хипертония (60), и допълнително подкрепят идеята, че чревната микробиота представлява бъдеща терапевтична цел за сърдечно-съдови заболявания (30).

Моделите на гризачи при затлъстяване, индуцирано от Западна диета, показват сходни промени на нивото на филум в техния микробен състав като тези, наблюдавани при затлъстели индивиди, включително повишено съотношение Firmicutes: Bacteroidetes (40, 62) и тези промени са свързани с метаболитни смущения (8) . Потискането на чревната микробиота с антибиотици се използва в многобройни животински модели, за да се установи причинно-следствената роля на чревната микробиота в риска или прогресията на заболяването (11, 37, 52, 61). Например, антибиотиците са използвани за установяване на задължителна роля на чревната микробиота в производството на проатерогенното съединение триметиламин н-оксид (TMAO) (65).

Ние признаваме, че липсата на допълнителна контролна група, хранена със стандартна диета (SD) и приемаща антибиотици, е значително ограничение на настоящото проучване. Предишни изследвания не са наблюдавали ефект от антибиотично лечение при контролни мишки с ниско съдържание на мазнини, хранени с диети, върху маркери на ендотоксемия или метаболитни параметри (8, 11). Като се има предвид, че SD-хранените мишки показват нормална съдова функция, ние не сме очаквали, че включването на SD + Abx група ще даде някаква значима представа относно ролята на чревната дисбиоза за медииране на съдова дисфункция. Въпреки това, ние забелязахме леко свързано с възрастта увеличение на aPWV в нашата SD група. По този начин, ако това увеличение е свързано с промени в микробния състав, тогава антибиотичното лечение може да смекчи това увеличение. Независимо от това ограничение, нашите резултати показват, че индуцираната от диетата дисбиоза представлява важен фактор за развитието на съдова дисфункция.

В заключение, настоящата работа потвърждава предишни изследвания, свързващи чревната дисбиоза с ендотелната дисфункция и е първата, която демонстрира, че потискането на чревната дисбиоза обръща артериалната скованост, предизвикана от западната диета. Данните също така предоставят механистичен поглед върху медиаторите надолу по веригата на тази дисфункция и предоставят допълнителна подкрепа за развитието на терапии, насочени към микробиота при лечението и профилактиката на сърдечно-съдови заболявания.

Това проучване беше подкрепено от Програмата за биомедицински изследвания на Webb-Waring Foundation на C. Bottcher (C. L. Gentile).

Не се декларират конфликти на интереси, финансови или други, от авторите.