Резюме

Аномалии в протеиновото гликозилиране се съобщават при фруктоземия (HFI) и галактоземия, въпреки че, особено при HFI, публикуваните данни са ограничени до единични случаи. Целта беше да се изследва полезността на профила на въглехидратен дефицит на трансферин (CDT) за идентифициране и проследяване на тези нарушения. Първо анализирахме стойностите на CDT преди и малко след диагнозата при 10 случая на HFI и 17 случая на галактоземия. При всички пациенти са установени повишени нива на CDT, които значително (стр

въглехидратен

Рутинната диагноза на фруктоземия (McKusick 229600) се основава на клиничните характеристики на непоносимостта към фруктоза, биопсия на черния дроб за оценка на активността на алдолаза В и/или тест за предизвикване на фруктоза (1). Клинични и ензимни методи също се използват за откриване на галактоземия (McKusick 230400) в популациите, които не са обхванати от неонатален скрининг на популация (2). Закъсненията при диагностицирането на двете потенциално лечими вродени грешки в метаболизма при новородени и кърмачета водят до сериозни, понякога фатални, необратими последици.

Докато проба от суха кръв може да бъде изпратена до метаболитна лаборатория за лесно откриване на галактоземия, не е наличен прост метаболитен тест за бързо идентифициране на наследствена непоносимост към фруктоза (HFI). Диагностиката на HFI изисква хоспитализация в специализиран център и на практика често включва потенциално опасни процедури. Aldolase B (ALDOB) скринингът за генна мутация представлява безопасна алтернатива, но няма абсолютна чувствителност, относително е скъп и на практика често е ограничен до носители на често срещани мутации в ALDOB ген (3-5).

През 1996 г. съобщихме, че обратимото хипогликозилиране на н-гликопротеините, имитиращи вродени нарушения на гликозилирането (CDG) тип I в модела на трансформинови изоформи, е една от биохимичните характеристики на нелекуваната HFI (6). Механизмът на CDG аномалиите при HFI впоследствие беше изследван от Jaeken et al. (7), който постулира инхибирането на фосфоманозната изомераза от фруктоза-1-Р в черния дроб, бъбреците и червата. По-рано беше установено необичайно гликозилиране на трансферин при нелекувана галактоземия (8–10). Механизмът на абнормно гликозилиране при пациенти с дефицит на галактоза-1-фосфат уридилтрансфераза не е напълно изяснен, но неотдавнашните наблюдения сочат галактоземията като вторичен, „двоен“ CDG с комбиниран дефект на сглобяване и обработка н-гликани (11).

От 1997 до 2005 г. оценката на CDT се използва широко в нашия център главно като част от метаболитния скрининг за първични нарушения на гликозилирането (12), проведен в рамките на европейските програми EUROGLYCAN и EUROGLYCANET. Интересното е, че наблюдавахме, че HFI или галактоземията са окончателните диагнози при относително много деца с повишен CDT. За допълнително увеличаване на полезността на определянето на CDT при диагностицирането на тези състояния, ние също въведохме тест, базиран на нормализиране на CDT след изключване на фруктоза или галактоза.

Целта на това проучване беше да представи CDT за оценка като алтернативен метод за идентифициране на пациенти с фруктоземия (и галактоземия). Също така искахме да проучим потенциалното използване на определянето на CDT при проследяване на спазването на диета с ограничена фруктоза при HFI.

ПРЕДМЕТИ И МЕТОДИ

Изследването, проведено от 1997 до 2005 г., обхваща 31 деца с фруктоземия и 17 деца с галактоземия. Изследването е одобрено от местния биоетичен комитет. Получено е информирано съгласие от родителите и по-големите засегнати деца.

HFI е диагностициран въз основа на орален тест за натоварване с фруктоза (OFLT) и/или наличието на ALDOB генни мутации на двете хромозоми, с изключение на пет деца, които са били диагностицирани ex juvantibus, след изразена клинична нормализация на диета без фруктоза (FFD). Галактоземията се потвърждава чрез рутинно количествено определяне на активността на галактоза-1-фосфат уридилтрансфераза в еритроцитите.

Първата част от проучването обхваща 10 пациенти с HFI и 17 пациенти с галактоземия, които са били включени по време на тестване в нашия национален педиатричен метаболитен център, преди да бъде установена диагнозата. Възрастта при диагностициране варира от 2 месеца до 7 години (медиана 16 месеца) за HFI и от 8 дни до 16 месеца (медиана 26 дни) за галактоземия. При тези пациенти CDT е оценен преди или малко след въвеждането на лечението и след това последван от измервания след 2–4 седмици рестрикция на фруктоза или галактоза. Влиянието на рестрикцията на фруктоза е изследвано и в референтната група от четири деца с CDG с известна етиология, различна от HFI.

Във втората част на проучването, изследващо дългосрочното съответствие с FFD и възможното му влияние върху развитието, са изследвани 25 деца с HFI (включително четири пациенти с HFI, идентифицирани в първата част на проучването). При всички тях CDT тестът е извършен в последователни консултации. В даден момент ние също така оценихме състава на диетата и физическото развитие на децата (телесно тегло и височина спрямо средните стойности на населението), наличието на хепатомегалия, кръвна картина, нива на желязо и магнезий, избрани параметри, указващи увреждането на черен дроб (трансаминази, холестерол, протромбиново време, коагулационни тестове) и бъбреците (калциемия и калциурия, алкална фосфатаза, рН на кръвта, нива на пикочна киселина в серума и пикочните пътища, резорбция на фосфати), както и функцията на щитовидната жлеза (тироид-стимулиращ хормон, свободен трийодтиронин тироксин). Възрастовият диапазон на участниците в проучването по време на проучването е бил 3–20 години (средно 9,2 ± 4,7 години), а целият период на наблюдение е бил 0,5–18 години (средно 9,4 ± 6,0 години, медиана, 10 години).

Тест за орална толерантност към фруктоза.

След едно нощно гладуване, на 0800 h, 20% разтвор на фруктоза се прилага перорално в доза от 0,5 g/kg за 5 минути. Взема се проба от кръв на изходно ниво и 15, 30, 45 и 60 минути. след зареждане. Определени са нивата на глюкоза, фруктоза, лактат и в някои случаи нива на пикочна киселина и фосфат. Тестът се счита за диагностичен, ако се появи хипогликемия, хипофосфатемия, повишаване на концентрацията на фруктоза, лактат и пикочна киселина. Тестът беше прекъснат от i.v. приложение на глюкоза при поява на хипогликемия.

Скрининг на генна мутация ALDOB.

Мутационният скрининг се извършва чрез директно секвениране на кодиращите екзони и местата на снаждане на ALDOB ген, както е описано преди (5).

Изоелектрично фокусиране на трансферин (IEF).

Изоформите на трансферин от наситени с желязо серуми (железен цитрат/натриев бикарбонат) се разделят на 1% агарозен гел (Iso-Gel агароза FMC) с 5% амфолин в рН диапазон 5,0–7,0 (Pharmacia Fine Chemicals) на апарат Multiphore 2117 (LKB) с модифициран капак на електрода (междуелектродното разстояние е намалено до 5,6 cm). След IEF трансферинови изоформи се визуализират чрез имунофиксация (поликлонален заешки анти-човешки трансферинов серум, DAKO) и оцветяване на Coomassie blue R-250. OD на отделените ленти се определя с помощта на Appraise денситометър (Beckman). % CDT се изразява като сбор от фракции на азиало-, монозиало- и дизиалотрансферин. Референтните стойности на% CDT при 60 здрави деца са в диапазона от 1,5 до 6,2 (средно 3,9, SD ± 2,3).

Оценка на диетата.

Диетата се оценява чрез 3-d метод за записване на храна, като се използват изчислени тегла. Консумацията на енергия, протеини, мазнини, въглехидрати и витамин С е изразена като процент от препоръчания полски дневен прием (RDI). Съдържанието на фруктоза в диетата се изразява в mg/kg/d. 3-дневният запис на храната се съхранява от родителите на всеки от пациентите с HFI у дома за времето, непосредствено предшестващо датата на амбулаторното посещение в нашия отдел за клинично и биохимично изследване (включително CDT анализ).

РЕЗУЛТАТИ

CDT срещу лечение при HFI.

Преди лечението при всички деца с окончателна диагноза HFI нивата на CDT бяха повишени, докато въвеждането на FFD доведе до тяхното нормализиране или значително намаление, очевидно след 2–4 седмици (фиг. 1). Средните стойности на CDT са били 27,3 ± 11,5% (максимум 48,7%) преди FFD и 9,3 ± 5,1% след хранително лечение. Тази разлика беше много значима (стр Фигура 1

% CDT преди (твърди колони) и след (отворени колони) диета с ограничена фруктоза при пациенти с HFI (числа 1–10) срещу референтни случаи (CDG, галактоземия). Стойностите в колони показват броя на дните на FFD. При двама пациенти (9 и 10) са налични само резултатите преди поставяне на диагнозата. ALDOB генните мутации за пациенти 1–3 и 5 са ​​показани в Таблица 1. Мутациите при останалите пациенти от Фигура 1 са както следва: пациент 4: A150P/A175D; пациент 6: A150P/-; пациенти 7 и 8: няма мутация в екзон 5, други екзони не са тествани; пациент 9: A150P/A150P; пациент 10: Y174X/Y174X. R, референция (лента, средна стойност; вертикална линия, горен диапазон).

CDT срещу лечение при галактоземия.

Преди лечението при всички деца с галактоземия нивата на CDT бяха повишени, докато въвеждането на диета с ограничено действие на галактоза доведе до тяхното нормализиране или значително намаляване очевидно обикновено само след няколко дни (фиг. 2). Съответните средни стойности преди и след лечение са били 43,8 ± 14,1% (максимум 61,6%) срещу 11,2 ± 4,0% (стр Фигура 2

% CDT преди (плътни колони) и след (отворени колони) диета без мляко при пациенти с галактоземия. Стойностите в отворените колони показват броя дни на диета без мляко. За двама пациенти (13 и 14) са налични само резултатите преди поставяне на диагнозата, докато при трима (15, 16, 17) са налични само резултатите след въвеждане на диетично лечение. Пациент 4 е бил несъзнателно изложен на галактоза в продължение на 10 дни след 48 дни диета без галактоза. R, референция (лента, средна стойност; вертикална линия, горен диапазон).

Мониторинг на CDT стойностите по време на лечението на фруктоземия.

Стойностите на% CDT по време на диетично лечение на фруктоземия варират от 3% до 25,8% (средно 11,3 ± 5,5%). От общо 134 определяния в група от 25 деца, само 30 са били в нормални граници (CDT Таблица 1 Дългосрочно наблюдение на% CDT стойности на пациенти с HFI на диета с ограничена фруктоза

Развитие и биохимични параметри при лекувана фруктоземия.

Физическото развитие показва черти на дефицит, проявяващи се главно като дефицит на височина. Средните SD за височина и телесно тегло са височина, -0,97 ± 1,45 SD; тегло, -0,38 ± 1,17 SD. Най-ниската наблюдавана нормализирана индивидуална височина е -2,6 SD.

Патологично повишена фракционна екскреция на пикочна киселина> 15% е установена при 16 от 25 тествани деца и обикновено е придружена от намалена серумна концентрация на пикочна киселина до

ДИСКУСИЯ

Молекулярните данни за честотата на заболяванията в различни популации показват, че HFI е сравнително често срещано заболяване (приблизително 1: 20 000 раждания), но всички автори са съгласни, че е значително по-слабо диагностициран. Необходимостта от бърза диагностика на HFI става все по-неотложна в светлината на нарастващото използване на преработени храни, съдържащи изкуствени подсладители (сорбитол, фруктоза, твърди царевични сиропи с високо съдържание на фруктоза), което прави все по-голям брой неразпознати пациенти да станат симптоматични (12,13).

В нашето проучване беше установено, че определянето на серумен CDT е ефективен метод за идентифициране на HFI и галактоземия. Тези резултати са от особено значение по отношение на HFI, за които не е наличен прост метаболитен тест. Диагнозата HFI е поставена със значително закъснение от началото на симптомите, средно, на възраст от 23 месеца. По същия начин, както е описано в литературата, много от пациентите с HFI са били хоспитализирани многократно и подложени на диагностични биопсии на черния дроб, мускулите и бъбреците, както и на ензимно и молекулярно тестване за различни метаболитни заболявания (12–18).

Забавянията при диагностицирането на HFI са чести не само от нашия опит. Времето за диагностициране на HFI в педиатричните метаболитни центрове може значително да надвиши „примерното“ време от 1 месец, дадено в скорошния анализ от Торонто (19). Неврологичните симптоми (20), хипогликемия, както и повтарящо се повръщане и изолирана хипертрансаминаземия (21) се срещат и при вродено разстройство на гликозилиране тип Ib (22,23) и могат да насочат метаболитната диагностика в грешна посока.

В нашето проучване CDT беше изненадващо повишен и при децата с HFI при продължително диетично лечение. Нормални стойности на CDT са открити само в 30 от общо 134 определяния; освен това тези стойности се подобряват в отделни случаи чрез редовни консултации с опитен диетолог. Страничен ефект от дългосрочното стриктно избягване на фруктоза беше очевидно небалансираната диета, съдържаща излишни протеини и мазнини, недостиг на въглехидрати и често недостиг на енергия. Подобни качествени и количествени промени в състава на диетата са докладвани от Mock и др. (24) в двата им случая на HFI.

Според нас нивото на CDT по време на лечението на HFI обективно отразява приема на фруктоза и превъзхожда диетичния анализ, базиран на хранителни дневници. По същия начин, при галактоземия, беше показано, че абнормните гликоформи продължават да съществуват при диета с ограничена галактоза и се предполага, че откриването на CDT може да бъде полезен предиктор за резултата от лечението при това заболяване (10).

Остава да се покаже дали по-малко от задоволителното съответствие с ДФО има дългосрочни неблагоприятни последици. В нашето проучване средната височина на всички пациенти с фруктоземия на FFD е по-малка в сравнение със здравата популация. Трудно е да се определи дали дефицитът на височина при пациенти с HFI се дължи на наличието на следи от фруктоза в диетата или на качествени и количествени диетични недостатъци, които са страничен ефект от елиминационната диета.

Други автори също са направили това наблюдение. Подигравка и др. (24) предполага, че дефицитът на растеж при фруктоземия се причинява от неадекватно ограничаване на фруктозата. Диетите на две деца с ранна диагноза HFI, които проявяват растежен дефицит, съдържат 110-450 mg/kg фруктоза на ден, без да причиняват симптоми на непоносимост под формата на необичайна коремна болка, повръщане, симптоматична хипогликемия или хепатопатия. Намаляването на приема на фруктоза до 20–40 mg/kg/d (24) доведе до нарастващ растеж (от -2,40 SD на +0,3 SD и от 25-ти до 97-ия процентил). Специално диетично проучване със строго и спокойно краткосрочно ограничаване на фруктозата разкри корелация между нивата на серумна фруктоза и нивата на пикочна киселина и магнезий (24).

Последните проучвания съобщават, че едновременното съществуване на цьолиакия също може да доведе до дефицит на растеж при HFI (25). Ние не изследвахме тази възможност в нашето проучване. Независимо от причините за дефицит на растеж при фруктоземия, нашите резултати показват необходимостта всеки пациент с HFI да бъде под редовните грижи на опитен метаболитен диетолог.

В нашето проучване ние също открихме отклонения в метаболизма на пикочната киселина при деца, засегнати от HFI, дълго след установяването на диагнозата. Повишената бъбречна загуба на пикочна киселина, свързана с по-ниски серумни нива на пикочна киселина, показва нарушена тубулна резорбция. Влиянието на фруктоза, по-точно фруктоза-1-фосфат (F-1-P), върху метаболизма на пикочната киселина е добре известно (12,13,24) и се отнася и за здрави индивиди. В краткосрочен експеримент серумното ниво на пикочната киселина се е увеличило след натоварване с фруктоза, като този ефект е по-отчетлив при лица, засегнати от фруктоземия. Известно е, че F-1-P изчерпва аденозин трифосфатния басейн и стимулира метаболизма на пурините. Хиперурикозурията при HFI се причинява от два механизма: свръхпроизводството на пикочна киселина (споменато по-горе) и недостатъчно повторно поемане в резултат на тубулопатия тип Fanconi-DeToni-Debre. Интересното е, че в нашето проучване само ефектът на F-1-P върху бъбречната фаза на пътя на пикочната киселина стана очевиден при деца, консумиращи следи от фруктоза. Нивото на пикочната киселина в серума не е повишено, но често е било на или под долната граница на нормата (Таблица 1). Докладите за появата на хипоурикемия при HFI са спорадични (15). Важността на това наблюдение изисква проучване с по-голям брой участници.

В нашето проучване, чрез изследване на серумен CDT като част от ранния симптоматичен скрининг за метаболитни нарушения, ние поставихме първоначална диагноза на 17 случая на галактоземия при новородени и малки бебета в допълнение към идентифицирането на случаи на фруктоземия. Честотата на галактоземия се оценява на 1: 23 000 до 1: 44 000 раждания (26). Според груба оценка броят на случаите, открити в това проучване, възлиза на 28% от всички несвързани пациенти с галактоземия, диагностицирани през същия период в Полша. Трябва да се подчертае, че за разлика от ензимните анализи, кръвопреливането не влияе върху стойностите на CDT при нелекувана галактоземия. Ограничение на този тест е, че резултатите могат да бъдат неясни преди 2 седмици и са ненормални (и диагностични) само когато млякото е включено в диетата.

В обобщение, нашите резултати показват, че повишеният CDT и неговото нормализиране при диетично лечение е полезен биохимичен тест за HFI и галактоземия. Също така, CDT анализът може да се използва за наблюдение на спазването на FFD, което изглежда е значителен неразпознат проблем при пациенти с HFI.

Съкращения

ген на алдолаза В

вродени нарушения на гликозилирането (по-рано гликопротеин с дефицит на въглехидрати)