Geeta D. Thakker

1 Секция за атеросклероза и съдова медицина, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

Николаос Г. Франгоянис

2 Секция за сърдечно-съдови науки, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

Павел Т. Зимек

2 Секция за сърдечно-съдови науки, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

Саумя Шарма

4 Отдел по кардиология, Катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Тексаския университет в Хюстън, Хюстън, Тексас

Джо Л. Рая

1 Секция за атеросклероза и съдова медицина, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

Филип М. Баргер

3 Секция по кардиология, Катедра по медицина, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

Хайнрих Тегтмайер

4 Отдел по кардиология, Катедра по вътрешни болести, Медицински факултет на Тексаския университет в Хюстън, Хюстън, Тексас

Марк Л. Ентман

2 Секция за сърдечно-съдови науки, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

Кристи М. Балантайн

1 Секция за атеросклероза и съдова медицина, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас

5 Център за профилактика на сърдечно-съдови заболявания, Методист DeBakey Heart Center, Хюстън, Тексас

Резюме

Въведение

Затлъстяването често се придружава от инсулинова резистентност и е свързано с метаболитни аномалии, а именно хипергликемия, повишени концентрации на свободни мастни киселини в плазмата и извънматочно натрупване на липидни метаболити в неадипозни тъкани като скелетни мускули, черен дроб и сърце. Има все повече доказателства, че прекомерното натрупване на липиди в кардиомиоцитите е токсично и допринася значително за сърдечни нарушения, често свързани със затлъстяване и/или диабет (1).

Методи и процедури за изследване

Грижа за животните

Всички животни са получили хуманни грижи в съответствие с „Ръководство за грижа и използване на лабораторни животни“ (NIH публикация 85–23, преработена 1985 г.) и протоколът е одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Медицинския колеж Baylor. C57BL/6J мишки (The Jackson Laboratory, ME) са били отглеждани в дома. На мишки (3–5 на клетка) беше разрешен достъп ad libitum до вода и съдържаща стандартна чау диета

13,5% ккал от мазнини (Picolab Diet Diet 5010, Purina Mills, Inc, Сейнт Луис, Мисури) след отбиване до 6-8-седмична възраст. Затлъстяването се предизвиква, като се позволява достъп до либит до диета с високо съдържание на мазнини

42% ккал от мазнини (Dyet # 112734, Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ), започвайки на възраст 6-8 седмици в продължение на 24 седмици. Слабите контроли продължават да се хранят с диу чау до момента на експеримента.

Определяне на сърдечната мастна киселина чрез газова хроматография – масспектрометрия

Проучвания за окисляване на мастни киселини in vitro

Проучванията на FAO са проведени при сърдечни хомогенати от слаби и затлъстели мишки по протокол, описан от Sekiguchi et al (15), използвайки [1- 14 C] палмитинова киселина. Капацитетът на β-окисление на FA се изразява като cpm/mg сърдечна тъкан.

Екстракция на липиди и определяне на триглицеридите

Сърцата бяха изрязани и обработени за липидна екстракция, както е описано подробно от Thakker et al (16). Липидите се екстрахират с хлороформ, метанол и 0,9% натриев хлорид съгласно метода на Folch (17). Триглицеридите се измерват с наличен в търговската мрежа комплект (Sigma Diagnostics Inc.), като се използва триолеин като стандарт.

Кратка повтаряща се исхемия – реперфузия

Хистология и имунохистохимия

Вградените в парафин сърца бяха разделени на интервали от 200 μm от основата до върха. Срезите бяха оцветени с хематоксилин и еозин за първоначална оценка и идентифициране на зоната под шева. След първоначалната оценка серийните разрези бяха оцветени с пикросириус червено, за да се идентифицират колагеновите влакна (18). Слайдовете, оцветени с пикросириус, бяха сканирани с помощта на микроскоп Zeiss Axioskop и количествената оценка беше извършена с помощта на софтуера ImagePro, както е описано по-горе (19). Процентното оцветяване с колаген се оценява в предната стена след 5 дни повтарящи се I/R.

Проведена е имунохистохимия със специфично анти-мишо антитяло, за да се идентифицират следните типове клетки: неутрофили (анти-миши неутрофилни антитела на плъх, Serotec, Оксфорд, Великобритания) и миофибробласти (моноклонални α-гладкомускулни актинови антитела, Sigma, Сейнт Луис, MO ). Оцветяването се извършва с помощта на техника, базирана на пероксидаза, с комплекта Vectastain Elite (Vector laboratories, Burlingame, CA). Разрезите бяха оцветени с еозин и беше извършен количествен анализ чрез преброяване на плътността на белязаните клетки в предната стена след 5 дни повтарящи се I/R. Миофибробластите са идентифицирани като вретеновидни α-гладкомускулни актин-положителни клетки, разположени извън съдовата среда и тяхната плътност е изразена като клетки/mm 2 .

Експресия на гени чрез PCR в реално време

Методите за изолиране на РНК, синтез на cDNA и количествена RT-PCR са описани по-рано (20). Нуклеотидната последователност за праймери и сонди за PPAR-α, мускулен тип карнитин палмитоилтрансфераза-1 (mCPT-1) и средно-верижна ацил-коензим А дехидрогеназа (MCAD) също са публикувани по-рано (20, 21). Taqman праймери и сонди за PPAR-β/δ и 18S са получени от Applied Biosystems. Нивата на циклофилиновия транскрипт се определят, използвайки SYBR Green химия, като се използват публикувани праймерни последователности (22). Експресията се нормализира до нивата на 18S или циклофилин транскрипт. Вътрешните стандарти бяха изготвени, използвайки метода на Т7 РНК полимераза.

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Статистическите различия между групите бяха анализирани чрез несдвоения t-тест на Student. Данните, които не следват нормалното разпределение на Гаус, са анализирани чрез непараметричен тест на Ман-Уитни. Стойност от P≤0.05 се счита за значима.

Резултати

Мишките C57BL/6J, хранени със „западна“ диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 24 седмици, затлъстяват и развиват инсулинова резистентност. Мъжките затлъстели мишки са били приблизително 1,5 пъти по-тежки от слабите мъжки мишки (47,5 gm срещу 32,2 gm, P Таблица 1 обобщава FA състава на диетата с чау и "западните" с високо съдържание на мазнини. "Западната" диета с високо съдържание на мазнини съдържа значително по-високо наситени FA, 2 пъти повече ненаситени FA и по-голямо съотношение n-3/n-6 от диетата с чау.

маса 1

Състав на мастнокиселинните диети

Мастна киселина Show режим Диета с високо съдържание на мазнини
С4: 0-0,71
С6: 00,010,42
С8: 00,010,25
С10: 00,010,57
С12: 00,010,63
С14: 00,092.25
C14: 1 (n-9)0,010,34
С16: 00,905.88
C16: 1 (n-9)0,130,53
С18: 00,262.73
C18: 1 (n-9)1.105.63
C18: 2 (n-6)1.880,53
C18: 3 (n-3)0,170,32
С20: 00,010,23
C20: 4 (n-6)0,01-
20: 1 (n-9)0,02-
20: 2 (n-6)0,01-
20: 5 (n-3)0.10-
22: 6 (n-3)0,11-
22: 5 (n-3)0,02-
наситен1.2813.67
ненаситен3.557.33
n-61.900,53
n-30,390,32
съотношение n-3/n-60,200,60

Стойностите представляват тегловни проценти от общите мастни киселини в хранителните липиди.

Сърдечни липиди и окисляване на мастни киселини

30% по-високи от слабите мишки (74,67 ± 4,31 срещу 57,84 ± 3,48 cpm/mg сърдечно тегло, P Фигура 2). Нивата на транскрипт на PPAR-α и -β/δ при затлъстели фалшиви мишки са били регулирани

1,6-кратно в сравнение с постно мишни оперирани мишки. Повтарящият се I/R протокол значително намалява както PPAR-α, така и -β/δ при затлъстели мишки в сравнение със затлъстели фалшиви животни. При слаби животни, подложени на повтарящи се I/R, експресията на PPAR-α не е променена, но забелязваме умерено и значително увеличение на експресията на PPAR-β/δ. За да определим дали повишената експресия на PPAR-α и -β/δ корелира с повишената експресия на целевите гени, участващи във FAO, ние изследвахме експресията на mRNA на два целеви гена, mCPT-1 и MCAD, при слаби и затлъстели животни след I/R . Затлъстяването е свързано с повишена експресия на mCPT-1 и се наблюдава тенденция към по-висока експресия на MCAD (P = 0,08). Както бе отбелязано по-горе за PPAR-α и -β/δ, повтарящи се I/R значително намаляват експресията на mCPT-1 и MCAD при затлъстели, но не слаби животни (Фигура 2).

повтаряща

Диета-индуцирано затлъстяване променя сърдечната мастна киселина метаболизъм генна експресия. Нивата на транскрипт на PPAR-α, PPAR-β/δ и техният целеви ген mCPT-1 са значително увеличени при затлъстяване (n = 3) в сравнение с постно прикрити животни (n = 4). Нивата на транскрипция на MCAD са склонни (P = 0,08) да бъдат по-високи при затлъстели в сравнение с постно измамни животни. Repetitve I/R на 3 дни е свързано със значително понижаване на регулацията на PPAR-α, mCPT-1 и MCAD транскрипти при затлъстели мишки (n = 8), но не и при слаби мишки (n = 9) в сравнение със съответните бутафории. PPAR-β/δ беше значително регулиран при постно повтарящи се I/R животни, но беше понижен при затлъстели повтарящи се I/R животни в сравнение със съответните бутафории.

Сърдечни липиди и плазмени FFA след повтарящи се I/R

За да се обърне внимание дали понижаването на регулацията на гените на метаболизма на FA при затлъстели мишки след повтарящи се I/R води до промени в сърдечния липиден профил, измерихме липидите след 3 дни на повтарящи се I/R. Общите FFA остават значително повишени при затлъстели мишки след повтарящи се I/R (P Фигура 3а). В допълнение, сърдечната концентрация на триглицериди е значително повишена при затлъстели мишки след I/R (Фигура 3b). Тъй като често се наблюдават високи нива на FA след миокарден инфаркт или след реперфузия след сърдечна операция при хора, ние измерихме общите плазмени FFA след 3 дни повтарящи се I/R. Както е показано на Фигура 3в, плазмените FFAs в 3 дни на повтарящи се I/R са били значително по-високи при затлъстели от слаби животни.

Сърдечни FFAs, триглицериди и циркулиращи FFAs след 3 дни повтарящи се I/R. Сърдечните нива на FFAs C16: 1, C18: 0, C18: 1 и C20: 4 (A) и триглицеридите (B) са значително по-високи при затлъстели, отколкото слаби мишки, докато C18: 2 и C22: 6 (A) са по-висока при затлъстели мишки. Циркулиращите FFA (C) след 3 дни повтарящи се I/R бяха значително по-високи при затлъстели, отколкото слаби мишки.

Хистопатология след повтарящи се I/R

По-рано съобщавахме, че кратките епизоди на исхемия водят до обратима исхемична кардиомиопатия (11). Фигури 4 и и 5 5 обобщават хистологичната оценка при слаби и затлъстели мишки след 5 дни повтарящи се I/R. При слаби мишки забелязахме разширяване на интерстициума и изразена фиброза в предната стена без инфаркт. Затлъстелите мишки обаче реагираха неблагоприятно на тези кратки епизоди на I/R и развиха микроинфаркти. Микроинфарктът, както се очакваше, беше свързан с повишен възпалителен инфилтрат. Плътността на миофибробластите и фиброзата бяха значително увеличени при DIO мишки в сравнение с постни мишки. Плътността на неутрофилите също беше значително увеличена при DIO мишки (17,43 ± 6,98 клетки/mm 2) в сравнение с постни мишки (3,67 ± 0,75 клетки/mm 2; P = 0,04).

Повишена плътност на миофибробластите при затлъстели мишки след 5 дни повтарящи се I/R. Сърдечните миофибробласти са идентифицирани като вретеновидни α – гладки мускули актин – положителни клетки, разположени извън средата на съдовете (стрелки). α – гладкомускулният актин имунохистохимия също оцветява съдовите гладкомускулни клетки (върховете на стрелките). Плътността на миофибробластите (A) е значително по-висока при затлъстели (n = 7), отколкото слаби (n = 9) мишки. За сравнение на групите беше използван непараметричен тест на Ман – Уитни (Р = 0,04). Представително изображение на предната стена на слаби и затлъстели мишки изобразява миофибробласти (B).

Затлъстелите мишки са имали повишена фиброза, свързана с микроинфаркт след 5 дни повтарящи се I/R. Колагенът се открива чрез оцветяване с пикросириус и се определя количествено в предната стена на слаби (n = 9) и затлъстели (n = 7) мишки. Слабите мишки проявяват обширна интерстициална фиброза (стрелки) при липса на значителна загуба на кардиомиоцити. За разлика от това, затлъстелите мишки са имали микроинфаркт, придружен от заместителна фиброза (стрелки) и значително засилено отлагане на колаген (p McGavock JM, Victor RG, Unger RH, Szczepaniak LS. Пренаселеност на сърдечността, Ann Intern Med. 2006; 144: 517– 24. [PubMed] [Google Scholar]