1 Катедра по диагностична патология, Висше училище по медицина и фармацевтични науки, Университет в Тояма, Тояма, Япония

2 Катедра по микробиология и имунология, Национален отбранителен медицински център, Тайпе, Тайван

3 Катедра по японска източна медицина, Висше училище по медицина и фармацевтични науки, Университет в Тояма, Тояма, Япония

4 Институт за размножаване на животни, 1103 Fukaya, Kasumigaura-shi, Ibaraki 300-0134, Япония

5 Фармацевтичен факултет, Изследователски институт по фармацевтични науки, Университет Мусашино, 1-1-20 Shinmachi, Nishitokyo-shi, Токио 202-8585, Япония

6 Училище по медицина, Католически университет Фу Джен, град Ню Тайпе, Тайван

7 Отделение по хипербарична медицина и неврология, болница Кардинал Тиен, град Ню Тайпе, Тайван

РЕЗЮМЕ

Ефектът от лечението с хипербарен кислород (HBOT) беше изследван с помощта на MSG мишки, които са животински модел на затлъстяване, хиперлипидемия, диабет и неалкохолна мастна чернодробна болест. Деветнадесет MSG мъжки мишки бяха разделени на третирани с HBOT и контролни групи на 12-седмична възраст. HBOT групата е била лекувана с хипербарен кислород от 12 до 14 седмици (първа фаза) и след това от 16 до 18 седмици (втора фаза). Интересното е, че телесното тегло на HBOT групата е значително по-ниско (

) от този на контролната група. За разлика от това, серумните нива на липидите не показват значителни промени между двете групи. Що се отнася до ефектите от увеличаване на оксидативния стрес, чернодробната хистология на HBOT групата показва по-тежки клетъчни увреждания и анормален TNF-α израз. HBOT има предимството да подобрява затлъстяването при пациенти с метаболитен синдром, но вината за причиняване на увреждане на органите чрез увеличаване на оксидативния стрес.

1. ВЪВЕДЕНИЕ

„Метаболитен синдром“ е сериозен актуален въпрос. Метаболитният синдром се нарича „синдром на висцералната мастна тъкан“, тъй като натрупването на висцерална мастна тъкан и агрегациите на макрофаги, описани като „короноподобни структури“, се появяват предимно и след това причиняват различни неразрешими нарушения на цялото тяло [1, 2]. Чернодробният фенотип на метаболитния синдром се нарича „неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD)“, а неалкохолният стеатохепатит (NASH), който е критичният тип NAFLD, е рефрактерно прогресиращо заболяване, което прогресира до чернодробна цироза или хепатоцелуларен карцином [3–5 ]. Въпреки че изясняването на механизма зад патологичното състояние остава противоречиво, „теорията с два удара“ има подкрепа като патогенетичен механизъм на NASH. Предполага се, че простата стеатоза възниква в резултат на първото попадение и че патологичното състояние прогресира поради второ попадение като оксидативен стрес [6]. Това означава, че оксидативният стрес може да бъде обострящ фактор на чернодробно заболяване, причинено от метаболитен синдром.

2. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1. Експериментални животни

Мишката MSG е модел със затлъстяване на животни, който се приготвя чрез подкожно инжектиране на мононатриев глутамат (MSG) в ICR мишка веднага след раждането. Съобщава се, че тази мишка показва симптоми на затлъстяване, диабет тип 2, хиперлипидемия и безалкохолно мастно чернодробно заболяване след обичайно хранене, без да показва хиперфагия [23, 24]. Въпреки че е известно, че MSG мишките от двата пола показват различни симптоми на метаболитен синдром, мъжете показват по-тежки симптоми. MSG мишките обикновено се приготвят чрез прилагане на подкожна инжекция на MSG от 2 mg на g телесно тегло за последователни пет дни. Наскоро Сасаки и др. съобщава, че MSG мишки, приготвени с една подкожна инжекция от 4 mg MSG, показват по-тежко патологично състояние от тези, произведени по конвенционалния метод [25]. В настоящото проучване, 19 MSG мъжки мишки бяха приготвени съгласно метода на Sasaki et al.

2.2. Уча дизайн

Деветнадесет MSG мъжки мишки бяха разделени в групата, лекувана с HBOT (

) и контролната група (HBOT-нетретирана група) (

) на 12 седмична възраст. Групата, лекувана с HBOT, се лекува с HBOT (2,5 ATA/60 min/d) в продължение на 2 седмици от 12 до 14 седмична възраст в продължение на 1 час на ден (първа фаза). След това, след двуседмичен интервал, мишките бяха третирани с HBOT (2.5 ATA/60 min/d) за още две седмици от 16 до 18 седмични възрасти в продължение на 1 час на ден (втора фаза). Контролната група беше държана в камера под нормално налягане вместо HBOT за 1 час и снабдена с нормална концентрация на кислород. Мишките от всяка група бяха умъртвени след 12 часа на гладно след последното лечение с HBOT и техните серум, черен дроб и висцерална мазнина бяха извлечени.

2.3. Измерени параметри

Седмичното тегло се измерва от началото на експеримента до жертвата. В серума са били триглицеридите (TG), общият холестерол (T-хол), липопротеините с много ниска плътност (VLDL-), липопротеините с ниска плътност (LDL-) и холостеролът на липопротеините с висока плътност (HDL-) измерена. Профилите на холестерола и фосфолипидите в серумните липопротеини бяха анализирани с помощта на HPLC система с двойно откриване с две свързани тандем колони TSKgel LipopropakXL (300 mm × 7,8 mm; Tosoh, Токио, Япония) в Skylight Biotech (Акита, Япония).

Фиксирани във формалин парафинови проби от висцералната мастна тъкан и черния дроб бяха подготвени и анализирани патоморфологично. Хистопатологичните находки на черния дроб са оценени с помощта на системата за оценяване на мрежата за клинични изследвания NASH въз основа на четири полуколичествени фактора: стеатоза [0–3], лобуларно възпаление [0–3], балониране на хепатоцити [0–2] и фиброза [0–4 ], както е описано по-рано [26]. Резултатът за активност на NAFLD (NAS) се определя като непретеглена сума от оценките за стеатоза, лобуларно възпаление и балониране на хепатоцитите; по този начин оценките варират от 0 до 8. NAS от 0 до 2 се счита за не диагностика на стеатохепатит, а оценки от 5 или повече са взети като диагностика на стеатохепатит.

2.4. Имунохистохимия

Пет µОбразци с дебелина m от всяка проба бяха имунооцветени, използвайки стандартни имунооцветяващи процедури. Моноклонално антитяло от плъх срещу миши MAC-2 (Galectin-3) (Cedarlane, Hornby, Ontario; 1: 100 разреждания) се използва като маркер на макрофаги. Заешко поликлонално антитяло срещу миши TNF-α (Monosan, Uden, Холандия; 1: 20 разреждания) също се използва. Като вторични антитела бяха използвани хистофин-пероксидаза за първични антитела на плъхове (Nichirei, Токио, Япония) и Envision-пероксидаза (Envision-PO) (DAKO, Glostrup, Дания) за заешки първични антитела. За субстратната пероксидаза се прилага 3,3′-диаминобензидин (DAB). Във всички случаи бяха използвани оптимални разреждания и във всеки анализ бяха включени положителни и отрицателни проби.

2.5. Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен със Stat View версия 5.0 (Abacus Concept, Berkley, Calif, USA). Данните бяха изразени като средна стойност ± SE. Разликите между контролната и HBOT групите бяха анализирани с помощта на Student’s т-тест. Стойност на

се счита за статистически значима.

3. РЕЗУЛТАТИ

3.1. Промяна на теглото

Телесното тегло на мъжките MSG мишки, приготвени с еднократна подкожна инжекция на MSG в доза от 4 mg на g телесно тегло, нараства постоянно до 20-седмична възраст и след това плато до 28-седмична възраст. Между 12 и 18 седмична възраст скоростта на напълняване достига своя връх със средно увеличение от около 9 g на тегло. Промените в телесното тегло в това проучване са показани на фигура 1. В контролната група средното тегло е 56,0 g на 12 седмици, 59,2 g на 14 седмици, 61,8 g на 16 седмици и 64,5 g на 18 седмици стар, показващ постоянно увеличение. От друга страна, в групата, лекувана с HBOT, средното тегло е 56,8 g на 12 седмици, но бързо намалява до 53,6 g на 14 седмици, т.е. веднага след завършване на първата фаза на HBOT. Средното тегло се увеличава отново в периода на HBOT пауза и средното тегло е 57,9 g на 16 седмици; той обаче е бил 51,7 g на 18 седмици, което е след втората фаза на HBOT. Теглото на HBOT групата е значително намалено в сравнение с това в контролната група (Фигура 2).

лечението


Теглото на HBOT групата е значително намалено в сравнение с това в контролната група (Student’s т-тест,
3.2. Серумен липид

Серумните липидни нива на всяка група са показани в Таблица 1 и Фигура 3. В контролната група TG е 49,3 mg/dL, T-chol е 192,9 mg/dL, VLDL-chol е 8,7 mg/dL, LDL-chol е 41,5 mg/dL, а HDL-Chol е 142,7 mg/dL. От друга страна, в групата, лекувана с HBOT, TG се повишава до 61,6 mg/dL. Въпреки че T-Chol намалява леко до 175,1 mg/dL, VLDL-chol е 7,4 mg/dL, LDL-chol е 45,1 mg/dL, а HDL-chol е 121,7 mg/dL. Въпреки че няма статистически разлики между групите, LDL-холът е по-висок, а HDL-холът е по-нисък в групата, лекувана с HBOT.

Серумните нива на липидите на всяка група (Student’s т-тест).
3.3. Хистопатологично изображение на висцерални мазнини

В контролната група висцералната мазнина е значително увеличена и на някои места също се наблюдават подобни на короната структури (Фигура 4 (а)). Те представляват MAC-2-положителна агрегация на макрофаги (Фигура 4 (b)). От друга страна, в групата, лекувана с HBOT, липидните капчици са по-малки и броят на короноподобните структури има тенденция да бъде по-малък (Фигури 4 (в) и 4 (г)).

(а), (б) Висцерална мазнина от контролната група. Адипоцитите са значително увеличени. Често се наблюдават короноподобни структури (стрелки) (× 200) ((а) Н и Е оцветяване, (б) Mac-2 имунооцветяване като макрофагичен маркер) (в), (г) Висцерална мазнина от HBOT група. Адипоцитите са относително малки. Подобни на корона структури рядко се наблюдават (стрелки). (× 200) ((в) Н и Е оцветяване, (г) Mac-2 имунооцветяване като макрофагичен маркер).
3.4. Хистопатологично изображение на черния дроб

В контролната група се забелязват мастни промени в хепатоцитите в зоните3 до зоните2. Балонна дегенерация също е открита на различни места (Фигура 5 (а)). TNF-α експресия не се наблюдава в хепатоцити или Kupffer клетки (Фигура 5 (b)). Въпреки че също се наблюдава появата на липогранулом и фокална некроза и изображението се счита за еквивалентно на човешки NASH, не са очевидни тела на Мелори или мегамитохондрии и не се наблюдава фиброза. От друга страна, в групата, лекувана с HBOT, въпреки че нивото на мастна промяна е леко намалено в сравнение с това в контролната група, балонната дегенерация на хепатоцитите е по-интензивна и се появява широко. Телата на Mallory и кондензацията на субклетъчни органели също са наблюдавани спорадично (Фигура 5 (c) и нейното вмъкване), както и малки некротични огнища. Не се наблюдава фиброза. В няколко случая TNF-α експресия се наблюдава аферентно в хепатоцитите на перинуларната и перипорталната области; обаче не се вижда в клетките на Kupffer (Фигура 5 (d)). Оценката на чернодробната патология е показана в таблица 2.

(а), (б) черен дроб от контролната група. (а) Н и Е оцветяване, увеличение 200 ×. В Zone3-Zone2 се наблюдават умерени мастни промени. Дегенерация на балони се наблюдава спорадично. (б) TNF-α имунооцветяване, × 400 увеличение. Няма TNF-α експресия се наблюдава в хепатоцити или Kupffer клетки. (P: портални пътища, CV: централна вена) (c), (d) Черен дроб от HBOT групата. (в) Н и Е оцветяване, увеличение 200 ×. Мастните промени са по-малко тежки, докато се наблюдава изразена балонна дегенерация. Телата на Mallory се виждаха спорадично (вмъкване). (г) TNF-α имунооцветяване, × 400 увеличение. TNF-α експресия се наблюдава в хепатоцитите на перинуларната и перипорталната области; обаче не се вижда в клетките на Kupffer. (P: портални трактове, CV: централна вена).

4. ДИСКУСИЯ

както и участието на фосфорилиране на p38 MAPK [13]. Нашите непубликувани данни допълнително демонстрират, че лечението с HBO2 ефективно потиска туморния растеж от белодробен рак, прехвърлени SCID мишки след 14 дни (

) на туморен трансфер в сравнение с контролните мишки. Степента на преживяемост на мишките, третирани с HBO2, се увеличава значително в сравнение с контролните мишки. Тъй като оксидативният стрес е тясно свързан с развитието и прогресирането на метаболитния синдром и сърдечно-съдовите заболявания; следователно трябва да бъдем по-внимателни, за да подобрим този страничен ефект: първо, бихме могли да намалим налягането и продължителността във втората фаза на HBOT; второ, добавка от оптимални антиоксиданти може да бъде предписана във втората фаза на HBOT. Трябва да се направят бъдещи проучвания, за да се избегне HBOT-медиирано влошаване на чернодробната хистология.

Въпреки че механизмът на затлъстяването при MSG мишки все още не е ясен, се препоръчва увеличаване на теглото поради спад в консумацията на енергия. В нашето проучване също се оказа, че когато мишките MSG са били отглеждани със 75% от обичайния си прием на храна, нарастването на теглото и увреждането на черния дроб са идентични с тези, наблюдавани при мишките с нормален прием на храна (непубликувани данни). Въпреки че е необходимо бъдещо подробно изследване за механизма на загуба на тегло, предизвикан от HBOT, една възможност е, че бързото подобряване на системния метаболизъм поради достатъчното снабдяване с кислород в периферните тъкани е предизвикало загубата на тегло. Друга възможност е, че предотвратяването на свръхактивността на патогенните клетки във висцералната мастна тъкан и индуцирането на апоптоза причиняват загуба на тегло.

При тест за нивата на липид-асоциирани молекули в серума, се наблюдава леко повишаване на триглицеридите и LDL-хола в групата, лекувана с HBOT. Тъй като висцералната мастна кумулативна доза в черния дроб намалява в групата, лекувана с HBOT, липидите може да са мигрирали в кръвта от съхраняващите ги клетки. От друга страна, въпреки че кумулативната доза липиди в хепатоцитите е намалена в черния дроб, степента на хепатоцелуларното увреждане се влошава. Докато HBOT доставя достатъчно кислород на местните места, известно е, че предизвиква силен оксидативен стрес. Оксидативният стрес се счита за ключов ускорител на увреждането на клетките и онкогенезата като второто попадение на NASH [4–6]. Предполагаше се, че оксидативният стрес също играе роля в хепатоцелуларното увреждане, наблюдавано в настоящото проучване. Това показва, че HBOT е „острие с две остриета“, тъй като има предимството да подобрява затлъстяването и да причинява увреждане на органите чрез увеличаване на оксидативния стрес.

Пациентите с метаболитен синдром обикновено имат множество заболявания и често има много ограничения за лекарствата, които могат да приемат. Въпреки че HBOT има потенциала да се превърне в ефективно средство в подкрепа на ограничаването на диетата и терапевтичните упражнения, за практическа употреба са необходими допълнителни техники, като потискане на вредните ефекти на оксидативния стрес. Смята се, че приемът на антиоксиданти, като полифенол и витамин Е, е ефективен за намаляване на оксидативния стрес [33, 34]. Може да е възможно да се извлекат само ползите от HBOT, като се приемат антиоксиданти като добавки, преди и след лечението с HBOT. Важно е да се изследват различни условия на лечение с HBOT, за да се определят най-ефективните условия за лечение на метаболитен синдром.

ВНОС НА АВТОРА

Всички автори са участвали в проектирането, интерпретацията на изследванията, анализа на данните и прегледа на статията. K. Tsuneyama, YC Chen, M. Kujimoto и SY Chen проведоха експериментите, Y. Sasaki, W. Suzki, T. Shimada, S. Iizuka, M. Nagata и M. Aburada доставиха критични реактиви и опитни животни и K. Tsuneyama, YC Chan, M. Fujimoto и SY Chen пишат статията. Koichi Tsuneyama и Yen-Chen Chen допринесоха еднакво за тази работа.

ПРИЗНАВАНИЯ

Авторите благодарят на Tokimasa Kumada и Takeshi Nishida за техническата помощ. Това проучване беше подкрепено от безвъзмездна финансова помощ от асоциацията Interchange на ЯПОНИЯ (2008).

Препратки