Джиан Тиан

1 Институт за биотехнологии, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

предразположението

Юхонг Джанг

1 Институт за биотехнологии, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

Бо Лиу

1 Биотехнологичен изследователски институт, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

Dongyang Zuo

1 Институт за биотехнологии, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

Тао Дзян

1 Институт за биотехнологии, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

Джун Гоо

1 Биотехнологичен изследователски институт, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

Вей Джанг

2 Ключова лаборатория по земеделска геномика (Пекин), Министерство на земеделието, Пекин, Китай,

Нингфенг Ву

1 Биотехнологичен изследователски институт, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

Юнлиу Фен

1 Биотехнологичен изследователски институт, Китайска академия на земеделските науки, Пекин, Китай,

Замислени и проектирани експерименти: JT YZ JG YF. Изпълнява експериментите: YZ BL DZ TJ. Анализирани данни: JT YZ BL. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: DZ TJ. Написа хартията: JT YZ WZ NW. Проектира софтуера, използван в анализа: JT YZ.

Свързани данни

Резюме

Въведение

Pichia pastoris е един от най-често използваните организми за хетероложно производство на рекомбинантни протеини. Той е добре характеризиран, лесен за генетично манипулиране, изисква минимални предпазни мерки и може да се отглежда бързо и евтино до висока плътност на клетките [1], [2]. В допълнение, по-голямата част от рекомбинантните протеини, експресирани в този организъм, се секретират директно в хранителната среда. Тази преференциална секреция на рекомбинантни протеини позволява директното изолиране на целевите протеини от хранителната среда, елиминирайки необходимостта от скъпоструващи и нискодоходни клетъчни разрушения. Освен това, тази функция ограничава проблемите с токсичността в резултат на вътреклетъчното натрупване на целеви протеини. Не всички рекомбинантни протеини обаче могат да бъдат успешно секретирани в дрождите и вътреклетъчното задържане на някои силно експресирани протеини все още е проблем, ограничавайки по-широкото използване.

Разработени са разнообразни методи за подобряване на секрецията на рекомбинантни протеини в P. pastoris. Проучванията показват, че увеличаване на дозата на гена [1], промени в промотори или сигнални последователности [3] и съвместна свръхекспресия на молекулярни шаперони [4], [5], [6], протеин дисулфид изомераза (PDI) [7], [8] и разгънат протеинов фактор на отговор (UPR) [9] могат да подобрят секрецията на някои рекомбинантни протеини. Въпреки че ефикасността на тези методи е доказана за различни протеини, те може да не са достатъчни за протеини, които обикновено не се секретират от оригиналната клетка. Следователно опитите за експресия на такива протеини в P. pastoris може да отнемат значително време и ресурси, без начин да се предскаже вероятността за успех. Метод, който предвижда вероятността протеин да се секретира в супернатантата преди да бъде експресиран в P. pastoris, би имал значителна стойност; но доколкото ни е известно, подобен инструмент все още не е разработен.

Наскоро беше доказано, че секреционните сигнали съществуват във вътрешни области на протеини, извън традиционните N-терминални сигнални последователности. Например, единична мутация (N184Q или N250Q) в протеина hFasLECD може да повиши нивото на секреция на протеин, когато се изразява в P. pastoris [10], [11]. Изследване върху метилпаратион хидролаза OPHC2 (GenBank No.> CAE53631) екзогенно експресирано в P. pastoris показва високи нива на експресия (~ 5,5 g/L), използвайки 3 L ферментация с висока клетъчна плътност [12]; обаче друга метилпаратион хидролаза (MPH, GenBank No.> ACC63894), която споделя 46% идентичност на последователността с OPHC2, не се секретира в супернатантата на културата. Тези резултати предполагат, че вътрешните протеинови последователности могат да съдържат сигнали, които влияят върху секрецията. Следователно, тези последователности могат да се използват за предсказване на вероятността от секреция на протеин, когато екзогенно се експресира в P. pastoris.

В това проучване ние предлагаме метода Presep (Предсказване на склонността на протеин, който се секретира в супернатантата, когато се изразява в P. pastoris), за да идентифицира състоянието на секреция на протеини в P. pastoris въз основа на метода на ансамбъл за обучение случайни гори (RF) . Изграден е набор от данни (Secreprot), съдържащ 136 положителни протеина, експериментално доказано секретирани в супернатантата при експресия в P. pastoris, заедно с 957 отрицателни проби. За кодиране на тези протеини е използван метод на псевдоаминокиселинен състав (PseAAC). Както прогнозираните, така и експерименталните резултати показват, че Presep е ефективен класификатор за предсказване на склонността към секреция на даден протеин. Този метод може да се използва за прогнозиране и оптимизиране на възможността за секреция на даден протеин преди хетероложна експресия в P. pastoris.

Резултати и дискусия

Обучение и валидиране