Резюме

Заден план

Все повече се признава, че теглото и хранителният статус могат да повлияят на оцеляването на рака. По-рано сме показали, че затлъстелите мишки със сингенна остра лимфобластна левкемия (ALL) имат по-лош отговор на химиотерапевтичното лечение от контролните мишки. Поради това изследвахме дали диетичната намеса може да подобри резултата от най-често срещания педиатричен рак, ALL.

Методи

Индуцирани от диетата затлъстели мишки (DIO), отгледани с 60% калории от мазнини и контролни мишки, бяха имплантирани със сингенни ALL клетки. Някои DIO мишки са преминали на диета с ниско съдържание на мазнини. Оцеляването от ALL е оценено без или с химиотерапия, започвайки по време на смяната на диетата. Клетки от DIO мишки преди и след преминаване към диета бяха оценени чрез FACS за включване на BrdU и състояние на фосфорилиране на AKT, S6K и EIF2a. Подобни експерименти бяха направени с човешки ALL ксенотрансплантати. Миши и човешки ALL клетки се култивират в среда с 10% или 5% фетален говежди серум и се оценява чувствителността към химиотерапиите.

Резултати

DIO мишките са имали по-лоша преживяемост (17%) след монотерапия с винкристин, отколкото контролните мишки на 10% диета с ниско съдържание на мазнини (42%; н = 12/група; стр = 0,09, регистрационен ранг). Преминаването на затлъстели мишки на диета с ниско съдържание на мазнини преди началото на винкристин доведе до драстично подобрена преживяемост (92%, стр l-аспарагиназата, диетичният превключвател не подобрява преживяемостта на DIO мишки, лекувани с някое от лекарствата в монотерапия. По този начин изглежда, че диетичната намеса има уникален ефект за подобряване на ВСИЧКИ клетъчна чувствителност към винкристин in vivo.

Заключения

Тук докладваме, че диетичната интервенция може да подобри ВСИЧКИ резултати в предклиничен модел. Необходима е допълнителна работа за идентифициране на механизмите на този ефект и изследване на потенциалното въздействие върху човешката левкемия при пациентите.

Заден план

Затлъстяването увеличава честотата на много видове рак, а пациентите със затлъстяване имат по-висок риск от смъртност от тяхното заболяване [1]. През 2007 г. ретроспективен преглед на две големи кохорти демонстрира, че затлъстяването по време на поставяне на диагнозата увеличава риска от рецидив при деца с Национален институт по рака/Рим с висок риск от остра лимфобластна левкемия (HR-ALL) с 50% [2], откритие потвърдено в мета-анализ [3]. В отделна кохорта съобщихме, че децата със затлъстяване са 2,74 пъти по-склонни да бъдат положителни за минимално остатъчно заболяване (MRD) [4], което предвещава повишен риск от рецидив и намалена оцеляване без събития [5]. Освен това, неотдавнашни проучвания показват, че 1 на 3 деца с ALL са били с наднормено тегло или затлъстяване по време на диагнозата [6, 7].

Много внимание е отделено на ролята на диетата върху резултатите от рака. Мета-анализът показва, че оцелелите от рак, които поддържат висококачествени диети, имат по-ниска обща смъртност, макар и без значително намаляване на рецидивите на рака [8]. По-малко ясно е дали диетичната намеса по време на лечението на рака може да подобри резултата. Калоричното ограничение е привлякло много внимание в тази област, тъй като може мощно да намали инсулиноподобния растежен фактор 1 (IGF-1), стимулатор на клетъчния метаболизъм чрез активиране на оста PI3K/Akt/mTOR [9, 10]. Нетрансформираните клетки реагират на това ниско хранително състояние чрез понижаване на активността на mTOR и влизане в състояние на покой, което може да ги предпази от някои химиотерапии; обаче раковите клетки често проявяват конститутивна активация на PI3K/Akt/mTOR [11]. Това конститутивно активиране не може да бъде модулирано чрез ограничаване на хранителните вещества, което води до задържане или повишена хемочувствителност на раковите клетки [12, 13]. Допълнителни механизми също вероятно допринасят за благоприятните ефекти от ограничаването на калориите, включително намалена наличност на гориво, намаляване на възпалението и по-нисък оксидативен стрес [9, 14].

Разработихме модел на мишка, който рекапитулира клиничното наблюдение, че децата със затлъстяване имат по-лош ВСИЧКИ изход; мишките със затлъстяване (DIO) с високо съдържание на мазнини, имплантирани със сингенен ALL, имат по-лош резултат от преживяемостта след лечение или с винкристин (VCR), или с l-аспарагиназа [15, 16]. Въпреки това, дали ефектите от затлъстяването върху ВСИЧКИ изход при мишки или пациенти са обратими, остава неизвестно. Докато е доказано, че ограничаването на калориите подобрява ефикасността на химиотерапията при миши модели на солидни тумори [12], то не е тествано при най-често срещания детски рак, остра лимфобластна левкемия. Следователно, ние създадохме настоящото проучване, за да проверим дали диетичната интервенция може да подобри ВСИЧКИ изход при затлъстели мишки.

Методи

Клетъчна култура

Миши pre-B ALL клетки преди това бяха изолирани от BCR/ABL трансгенна мишка („8093 клетки“ [17]) и трансдуцирани с GFP. Клетъчните линии на човешката левкемия включват BV173 (преди B Ph + ALL, ATCC) и Nalm-6 (В-клетъчна прекурсорна левкемия, ATCC). Клетките бяха удостоверени от ядрото на Университета в Аризона през ноември 2016 г. и тествани отрицателно за микоплазма. Осем хиляди деветдесет и три клетки бяха култивирани в 5A среда на McCoy (Invitrogen), допълнена с 1 mM натриев пируват, 2 mM глутамакс, 10 μg/ml гентамицин и 5% или 10% FBS (Denville Scientific или Omega Scientific). Човешки клетъчни линии бяха култивирани в RPMI 1640 (Invitrogen), допълнена както по-горе. Експерименти с чувствителност към химиотерапия бяха проведени в продължение на 72 часа, с оцелели жизнеспособни клетки, преброени от заслепени наблюдатели в три екземпляра, използвайки ръчно изключване на трипан синьо, или с графиня II (ThermoFisher). Клетките LAX7 са получени от пациента ВСИЧКИ клетки с нормален кариотип, които са разширени чрез преминаване през NSG мишки (мишки, описани по-долу) и използвани за ксенотрансплантация [18]. Клетките се култивират върху OP-9 строма клетки с αMEM, допълнена с 20% FBS, 100 IU/mL пеницилин и 100 μg/mL стрептомицин.

Модели на мишки

Високомаслени диети, предизвикани от затлъстяване (DIO) и контролни мишки C57Bl/6J са закупени от Jackson Laboratories (Bar Harbor, MI, USA). Мишките са били отгледани с 60% (затлъстяване) или 10% (контролни) калории от мазнини (Research Diets, D12492 и D12450B, съответно). Тъй като женските мишки не стават толкова затлъстели в този модел и не са налични като DIO мишки от Jackson Laboratories, за тези проучвания са използвани само мъжки мишки. Мъжки NSG мишки (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ) са NOD/SCID IL2-рецепторни гама верижни мишки, които обикновено се използват за ксенотрансплантация. NSG мишките бяха затлъстели, използвайки селективно избиване и диета с високо съдържание на мазнини, както беше описано по-рано [19].

ВСИЧКИ експерименти за оцеляване

ВСИЧКИ имплантационни експерименти бяха проведени върху DIO и контролни мишки при

20-седмична възраст. По това време 10 000 GFP + пре-В-клетки ALL 8093 клетки бяха имплантирани ретро-орбитално. 6 или 7 дни след ВСИЧКОто имплантиране, в зависимост от експеримента, мишките DIO бяха рандомизирани, за да продължат диетата си с високо съдържание на мазнини, или преминаха към контролна диета (10% калории от мазнини, при условие, че е необходимо). В някои експерименти монотерапията с винкристин (0,5 mg/kg/седмично интраперитонеално) е започнала на 7-ми ден и тази доза се коригира спрямо телесното тегло всяка седмица. Подобни експерименти бяха проведени с l-аспарагиназа (800 IU/kg/ден, понеделник-петък) или дексаметазон (8 mg/kg/ден, понеделник-петък). В други експерименти DIO и контролните NSG мишки са имплантирани с LAX7 клетки и след 17-дневен период на присаждане половината от DIO мишките преминават към контролна диета. На 18 ден лечението с винкристин, l-аспарагиназа и дексаметазон (същите дози, както по-горе) започна и продължи 4 седмици. Мишките във всички експерименти за оцеляване се наблюдават ежедневно за прием на храна и телесно тегло и поява на прогресивна левкемия (парализа, прегърбена поза, осезаема маса> 1 cm, лошо поддържане и др.), Като по това време те са евтаназирани.

Събиране на тъкани и поточна цитометрия

Анализ на данни

Кривите на оцеляване на Каплан Майер бяха генерирани и сравнени с помощта на регресия на Кокс. Приемът на храна се измерва ръчно от клетката на мишката и се отчита като средни дневни или тридневни пълзящи средни, както е описано в резултатите. Жизнеспособните клетки и пропорциите на клетки, белязани с BrdU или други антитела, се сравняват между диетичен превключвател и DIO мишки, като се използват двустранни, сдвоени t-тестове. EC50 се изчислява чрез приспособяване на нормализираните данни за доза-отговор към уравнението: \ (\% жизнеспособни \ клетки = \ frac ^> \). Всички анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism и Microsoft Excel.

Резултати

Ограничението на диетата сенсибилизира ВСИЧКИ клетки към винкристин

За да определим дали смяната на диетата може да подобри ВСИЧКИ изход от лечението, ние имплантирахме 16 DIO и 8 не-затлъстели контролни мишки със сингенни ALL клетки (ден 0; Фиг. 1а). На 7-мия ден половината от DIO мишките са преминали на диета с ниско съдържание на мазнини, докато останалите са продължили на обичайната си диета (окончателно н = 8 на група). Времето за прогресиране на ALL не се повлиява от диетата при тези мишки (Фиг. 1b). При други групи мишки VCR започва на 7-ми ден и дозата на VCR се коригира седмично на базата на телесното тегло. В този експеримент DIO мишките, преминали към диета с ниско съдържание на мазнини, са имали най-доброто оцеляване, което е значително по-добро от мишките, поддържани на диета с високо съдържание на мазнини (стр Фиг. 1

диета

Диетичните ограничения при животните водят до голям брой хормонални, физически, физиологични и метаболитни промени, които не могат да бъдат напълно моделирани in vitro. Ограничението на FBS обаче може да симулира част от спада на растежните фактори, които се наблюдават при ограничаване на калориите и загуба на тегло. Намаляването на концентрацията на FBS повишава цитотоксичността на VCR (фиг. 2а); концентрациите на FBS под 5% обаче нарушават клетъчния растеж и жизнеспособност. Поради това използвахме 5% FBS, което не повлиява скоростта на тяхното разпространение, но ги прави значително по-чувствителни към VCR (фиг. 2б, в). Подобна сенсибилизация на VCR се наблюдава и при човешки ALL клетъчни линии, BV173 и Nalm6 (фиг. 2d – f).

Ограничението на диетата не променя ВСИЧКИя отговор на l-аспарагиназа или дексаметазон in vivo

Подобни ВСИЧКИ експерименти за оцеляване бяха направени както по-горе, но като се използва монотерапия с l-аспарагиназа или дексаметазон, започвайки на 7-ия ден. Превключването на диета нямаше забележим ефект върху оцеляването в тези експерименти (Фиг. 3а, b). Ограничението на FBS повиши чувствителността на 8093 клетки към дексаметазон (EC50 9,1 ± 2,3 срещу 16,3 ± 3,7 nM, стр = 0,02) и има тенденция да повишава чувствителността към l-аспарагиназа (EC50 0,80 ± 0,22 срещу 1,30 ± 0,21 IU/ml, стр = 0,13; Фиг. 3в, г), но не към Ara-C или даунорубицин (Допълнителен файл 1: Фигура S1). В допълнение, експериментите за оцеляване, проведени с човешки ALL ксенотрансплантирани NSG мишки, третирани с комбинация от винкристин, l-аспарагиназа и дексаметазон (VDL), показват, че мишките с ограничена диета нямат разлика в оцеляването от DIO или контролни мишки (Допълнителен файл 2: Фигура S2). По този начин ефектът от диетичното ограничение за сенсибилизиране на ВСИЧКИ към химиотерапевтично лечение in vivo изглежда е относително специфичен за VCR.

Ограничението на диетата не повишава чувствителността на ВСИЧКИ клетки на мишки към дексаметазон или l-аспарагиназа. а, б Оцеляване на мишки във всяка диетична група, лекувана с дексаметазон (а, н = 5–6) или l-аспарагиназа (б, н = 6). ° С, д Жизнеспособни клетки след 72 часа в културална среда с 5 или 10% FBS, самостоятелно или със 70 пМ дексаметазон (° С) или 2,5 IU/ml L-аспарагиназа (д), н = 3

Диетичното ограничение не променя скоростта на клетъчния цикъл на гостоприемника или ВСИЧКИ клетки

За да се изследва дали диетичното ограничение променя чувствителността на клетките към VCR чрез промяна на ALL или скоростта на циклиране на клетките-гостоприемници, клетките се събират от групи DIO мишки преди или след превключване на диета, 4 часа след инжекциите на BrdU. ALL и клетките гостоприемници се разделят чрез FACS от далаците и костния мозък на DIO мишки на 6-ия ден след имплантирането на ALL (преди всяко преминаване към диета), 8-ия ден (1 ден след преминаване към диета) или 14-ия ден (7 дни след преминаване към диетичен режим). Процентът на GFP + ВСИ клетки в S фаза се определя и сравнява с GFP-клетки-гостоприемници (спленоцити или клетки на мозъка) от същите тъкани. Процентът на клетките в S фаза е по-висок в ALL клетките на далака, отколкото non-ALL клетките, но сходен между ALL и non-ALL клетки от мозъка (Допълнителен файл 3: Фигура S3). Превключването на диета не променя значително този процент нито в двата типа клетки.

Ограничението на диетата не променя AKT сигнализирането в гостоприемника или ВСИЧКИ клетки

За да се определи как ограничаването на диетата може да промени съответните вътреклетъчни сигнални пътища, получените от далак и костен мозък клетки от затлъстели и затлъстели мишки (описани по-горе) бяха белязани с антитела за EIF2a/pEIF2a, AKT/pAKT и S6K/pS6K и анализирани от поточна цитометрия. ВСИЧКИ клетки от двете тъкани показват по-високи нива на фосфорилиране на тези протеини, отколкото клетките гостоприемници в повечето проби (Допълнителен файл 3: Фигура S3), потвърждавайки по-високата скорост на метаболизма в раковите клетки. Превключването на диета обаче няма съществен ефект върху състоянието на фосфорилиране на който и да е от тези протеини в гостоприемника или ВСИЧКИ клетки.

Дискусия

Тук докладваме, че преминаването на затлъстели мишки от диета с високо съдържание на мазнини към диета с ниско съдържание на мазнини подобрява ВСИЧКАТА преживяемост при лечение с винкристин от 17 на 92%. Това е първото проучване, за което сме наясно, че тестваме диетична интервенция върху резултата от лечението от хематологично злокачествено заболяване.

Други проучвания са оценили дали диетичната намеса може да повлияе на резултата от лечението на солидния рак. Превключването на DIO мишки от диета с високо съдържание на мазнини към ниско съдържание на мазнини, подобно на настоящото проучване, подобрява преживяемостта от меланом при мишки, лекувани с дакарбазин [20]. Кетогенните диети, съдържащи много ниски въглехидрати, се използват за пациенти с неразрешима епилепсия и причиняват намаление на концентрацията на глюкоза в кръвта, но повишаване на циркулиращите свободни мастни киселини и кетони [21]. Доказано е, че тези диети имат антитуморен ефект в 12 отделни модела на миши рак [22] и се оценяват при пациенти. Доказано е също, че гладуването и краткосрочното гладуване подобряват резултата от лечението на голямо разнообразие от солидни тумори при мишки [12]. Колко ефективни ще бъдат тези диети при пациенти с рак, предстои да разберем.

Нашите открития са в съответствие с ретроспективни данни, които показват, че обръщането на затлъстяването може да бъде свързано с подобрен ВСИЧКИ изход при младежите. Orgel и сътр. наблюдава, че ВСИЧКИ пациенти, които са спонтанно отслабнали и са преминали от затлъстяване в категория на затлъстяване по време на лечението си, са имали по-добър резултат от тези, които са останали със затлъстяване за> 50% от техния курс на лечение [23]. Въз основа на това наблюдение и настоящите ни констатации стартирахме клинично интервенционно проучване за леко диетично ограничение и повишена физическа активност при деца с новодиагностицирано ALL (ИДЕАЛНО тегло при ALL Trial; NCT 02708108). Това и подобни изследвания са от решаващо значение за определяне на това кои видове рак реагират на диетични интервенции и кои конкретни интервенции работят за кои видове рак.

Въпреки че лечението на детските ALL води до съществени подобрения в оцеляването, все още има

8% деца, които рецидивират от това заболяване всяка година [27]. Освен това децата с определени ВСИЧКИ подтипове, юноши и възрастни и пациенти със затлъстяване са изложени на повишен риск от рецидив и смъртност. Като се има предвид значителната токсичност на настоящите химиотерапевтични режими, е важно да се проучат алтернативни подходи за подобряване на ВСИЧКИ резултати, без да се добавят допълнителни химиотерапевтични агенти.

Заключения

Преминаването на затлъстели мишки с ALL от високомаслена към нискомаслена диета значително подобри преживяемостта с лечение с VCR, макар и не с лечение с l-аспарагиназа или дексаметазон. Констатацията, че диетичната интервенция може да подобри ВСИЧКИ резултата от лечението в предклиничен модел, трябва да бъде допълнително проучена, така че потенциалната полза от него да може да бъде оценена както при пациенти със затлъстяване, така и при пациенти със затлъстяване.