Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Програмата на Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Програмата на Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Кореспонденция

Рената Гера де Са, Институт за гражданство на Биологики, Департамент за биология на Сиенсиас, Университет Федерал де Оро Прето, Ору Прето, MG, Бразилия.

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Програмата на Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Програмата на Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилия

Кореспонденция

Рената Гера де Са, Институт за гражданство на Биологики, Департамент за биология на Сиенсиас, Университет Федерал де Оро Прето, Ору Прето, MG, Бразилия.

Резюме

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Консумацията на прости въглехидрати, главно на преработени продукти с висока доза добавени захари, се е увеличила значително през последните десетилетия (Rippe & Angelopoulos, 2016; Yudkin, 1972). Увеличението на консумацията на захар на глава от населението е посочено в многобройни проучвания като една от причините за развитието на метаболитни заболявания като затлъстяване и диабет (Kelishadi, Mansourian, & Heidari-Beni, 2014; Malik, Schulze, & Hu, 2006 ). Всъщност проучванията показват, че консумацията на диети с високо съдържание на захар води до развитие на затлъстяване и метаболитни нарушения, характерни за човешкия метаболитен синдром, независимо от приема на калории (Oliveira et al., 2020; Pinto et al., 2016; Queiroz и др., 2014; Sousa et al., 2018).

Ползите от физическата активност се отчитат от 50-те години на миналия век, главно в намаляването на смъртността, причинено от хронични заболявания (Espeland et al., 2016). Физическото обучение има огромни ползи за човешкото здраве и проучванията показват, че упражненията, съчетани с ограничена диета с нискокалорична консумация, могат да бъдат ефективни при отслабване (Washburn et al., 2014). Това се обяснява главно с енергийно търсене, което предизвиква по-голямо окисление на мастните киселини, както и с по-високо производство на хормони, свързани с метаболитния контрол (Washburn et al., 2014). С цел да разбере ефектите от редовните физически упражнения върху диета с високо съдържание на захар, нашата изследователска група показа в предишно проучване, че обучението по плуване на модел плъх Wistar е успяло значително да намали индекса на затлъстяване при животните поради консумацията на високо съдържание на захар диета (Queiroz et al., 2012).

Въз основа на предишни данни от нашата изследователска група и новите открития за влиянието на микробиотата върху здравето на гостоприемника, ние се фокусирахме върху оценката дали обучението по плуване с натоварване може да обърне ефектите от диетата с високо съдържание на захар с хронична храна чрез модулиране на червата микробиота и като следствие подобряване на енергийния метаболизъм на гостоприемника.

2 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН РАЗДЕЛ

2.1 Животни, диета и физическа подготовка

В това проучване бяха използвани тридесет и два новоотбити (с 28 стари дни) мъжки плъхове Wistar (56.93 ± 5.2 g). Всички експериментални процедури са извършени в съответствие с бразилските насоки за експериментиране с животни на Националния съвет за контрол на експериментите с животни (CONCEA) и одобрени от Комитета по етика при използването на животните на Федералния университет на Оуро Прето (UFOP) (номер на протокола) 26/2016). Животните се държат в колективни клетки при контролирани светлинни условия (светли и тъмни цикли от 12:12 часа) и стайна температура 24 ± 2 ° C с достъп ad libitum към вода и храна.

Плъховете Wistar бяха разделени на случаен принцип в четири групи: заседнала стандартна чау диета (SSD, н = 8), тренирана стандартна чау диета (TSD, н = 8), заседнала диета с високо съдържание на захар (SHD, н = 8) и тренирана диета с високо съдържание на захар (THD, н = 8). Животните от SSD и TSD групи са били хранени със стандартна чау-чау (Nuvilab CR1®, Коломбо, Бразилия), съставена от 57,16% въглехидрати (като 0% добавена захар). Животните от групите SHD и THD са били хранени с диета с високо съдържание на захар, съставена от 66,86% въглехидрати (като 36,32% добавена захар). Таблицата за хранителния състав на диетите е публикувана преди това от литературата (Oliveira et al., 2020). Всички групи бяха хранени със съответните им диети през 15 седмици.

Тренировъчните групи (TSD и THD) преминаха редовно обучение по плуване. Протоколът за физическа активност се извършва в басейн (150 cm × 100 cm × 60 cm широк), съдържащ предварително загрята вода при 31 ° C ± 2 ° C. Адаптация към водната среда и тренировка по плуване беше извършена преди редовната физическа подготовка, както следва: През първия тренировъчен ден животните плуваха в продължение на 15 минути, а през следващите дни тя беше увеличена с 15 минути на ден, достигайки максимум 60 минути на четвъртия ден от адаптационната седмица. През втората седмица животните завършиха плувни сесии от 60 минути в продължение на пет дни. След този период, от третата седмица нататък, животните са били подлагани на 60-минутни плувни сесии всеки ден с натоварване от 2% от телесното им тегло в продължение на пет дни в седмицата. Тежестите бяха прикрепени към опашките им. След всяка плувна сесия животните се сушат, за да се избегне понижаване на телесната им температура. Този експериментален анализ продължи общо 15 седмици.

2.2 Вземане на проби и анализи на метаболитни параметри

На 15-та експериментална седмица животните (пет животни на група) бяха разпределени в метаболитната клетка за период от 24 часа. Пробите от изпражненията бяха събрани и незабавно съхранени във ултраниска фризер при -80 ° C за по-нататъшна екстракция и анализ на ДНК. В края на пробния период, 24 часа след приключване на протокола за физическа подготовка, животните бяха подложени на гладно и евтаназирани чрез вдишване на въглероден диоксид (100% газ от въглероден диоксид при степен на постепенно пълнене от 20% -30 % от обема на камерата на минута). Мастните накладки (ретроперитонеална, епидидимална и ингвинална) бяха дисектирани и претеглени, за да се оцени индекса на мастната тъкан, като се използва следното уравнение: (Тегло на мастната подложка (g)/телесно тегло (g) × 100) (Taylor & Phillips, 1996). Техните кръвни проби също бяха събрани и центрофугирани 800 rpm в продължение на 15 минути. След това в серума бяха измерени следните производители на биохимия: холестерол, креатинин, глюкоза, липопротеин с ниска плътност (LDL), липопротеин с висока плътност (HDL), урея, триглицериди и липопротеин с много ниска плътност (VLDL). Всички биохимични параметри бяха измерени с помощта на комплекти Bioclin/Quiabasa (Belo Horizonte, MG, Бразилия), съгласно протоколите на производителя.

2.3 Анализ на фекална микробиота

2.3.1 ДНК фекална екстракция

Фекалиите се държат замразени при -80 ° C до процеса на екстракция. Анализът за екстракция на ДНК се извършва съгласно Протокола H на Международните стандарти за човешки микробиоми за екстракция на ДНК на фекали (IHMS) (http://www.microbiome-standards.org/). Обаче, адаптация на този протокол беше направена преди стъпка 16: Хлороформ (1: 1) беше добавен в супернатанти, смесен за 5 минути и след това центрофугиран при 12 000 об/мин за 10 минути. Супернатантата се събира без междинни замърсители на слоя. След тази стъпка всички следващи процедури бяха извършени точно както е описано в протокола IHMS. ДНК се определя количествено с помощта на флуорометър Qubit 3.0 (Thermofisher Scientific). Замърсяването с протеини беше оценено чрез съотношението A260/A280 с помощта на нанодроп (Thermofisher Scientific), а целостта на ДНК беше оценена с 0.6% агарозна гел електрофореза.

Последователност и анализ на 16S рибозомни РНК гени

Съставът на чревния микробиом се оценява чрез прокариотна 16S рибозомна РНК (rRNA) генна последователност на ДНК, извлечена от изпражненията. V4 регионът на 16S рРНК гена се усилва с Foward праймер 515 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) и Обратен праймер 806 (TAATCTWTGGGVHCATCAGG) (Caporaso et al., 2011), следвайки инструкциите на производителя 16S RNA Illumina. Библиотека с чифт край е конструирана с помощта на Nextera ® DNA Library и е извършено високопроизводително секвениране на Illumina MiSeq, комплект V2 500 Cycle (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

2.4 Статистически анализи

Статистическите анализи бяха реализирани чрез пакетен софтуер GraphPad Prism, версия 6.01 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Всички анализи, използвани двупосочен ANOVA тест, са последвали post hoc теста на Bonferroni, като се има предвид стр- стойност

3 РЕЗУЛТАТА

3.1 Редовното обучение по плуване обръща обезогенния ефект, предизвикан от диетата с високо съдържание на захар

Таблица 1 представя резултатите от биохимичния анализ от различни серумни метаболити на експерименталните групи. Според резултатите серумните нива на триглицеридите и VLDL са били значително повлияни от диетата (стр ТАБЛИЦА 1. Биохимични параметри на плъхове Wistar са подали експерименталните групи: заседнала стандартна диета с чау (SSD), тренирана стандартна диета с чау (TSD), заседнала диета с високо съдържание на захар (SHD) и тренирана диета с високо съдържание на захар (THD) за 15 седмици

Групи параметри М ± SDстр- стойност SSD TSD SHD THD Diet Effect Training Effect Interaction
Холестерол mg/dl 83,0 ± 11,0 84,0 ± 16,0 75,0 ± 14,0 77,0 ± 21,0 > 0,99 > 0,99 > 0,99
Креатинин mg/dl 0,74 ± 0,18 0,64 ± 0,05 0,77 ± 0,05 0,88 ± 0,11 > 0,99 0.86 > 0,99
Глюкоза mg/dl 119,0 ± 15,0 122,0 ± 28,0 132,0 ± 11,0 126,0 ± 18,0 > 0,99 > 0,99 > 0,99
HDL mg/dl 23,0 ± 2,5 26,0 ± 2,0 23,5 ± 3,0 26,0 ± 5,0 > 0,99 0,82 > 0,99
LDL mg/dl 40,0 ± 6,0 41,0 ± 14,0 25,0 ± 11,0 32,0 ± 17,0 0,15 > 0,99 > 0,99
Триглицериди mg/dl 96,0 ± 33,0 83,0 ± 16,0 151,0 ± 42,0 a, c, a, c a Обозначава значителна разлика в сравнение с SSD групата.
c означава значителна разлика в сравнение с TSD групата. н: 8 животни на група.
95,0 ± 28,0 b b означава значителна разлика в сравнение с групата SHD.
0,99
VLDL mg/dl 19,0 ± 7,0 16,5 ± 3,0 30,0 ± 8,0 a, c, a, c a Обозначава значителна разлика в сравнение с SSD групата.
c означава значителна разлика в сравнение с TSD групата. н: 8 животни на група.
19,0 ± 6,0 b b означава значителна разлика в сравнение с групата SHD.
0,99
Урея mg/dl 56,0 ± 7,0 59,0 ± 17,0 48,0 ± 6,0 50,0 ± 19,0 0,75 > 0,99 > 0,99
  • Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (М ± SD). Данни, тествани с помощта на двупосочен ANOVA тест с корекция след теста на Bonferroni. стр a Обозначава значителна разлика в сравнение с SSD групата.
  • b означава значителна разлика в сравнение с групата SHD.
  • c означава значителна разлика в сравнение с TSD групата. н: 8 животни на група.

Данните за биометричните профили са представени в таблица 2. Консумацията на диета с високо съдържание на захар доведе до увеличаване на телесната маса на животните (стр ТАБЛИЦА 2. Биометрични параметри на плъхове Wistar са подали експерименталните групи: заседнала стандартна диета с чау (SSD), тренирана стандартна диета с чау (TSD), заседнала диета с високо съдържание на захар (SHD) и тренирана диета с високо съдържание на захар (THD) за 15 седмици

3.2 Анализ на фекалния микробиом

Ефектът от диетата с високо съдържание на захар и редовното обучение по плуване в чревната микробиота композиции на плъхове беше определен чрез 16S rRNA секвениране. Получените последователности са картографирани в базата данни със зелени гени. Средно показанията на 16S рРНК последователността за всяка проба (

580 хиляди) са получени от приложението 16S Basespace Illumina. Както се наблюдава в кривите на разреждане (Фигура 1а) (и тяхната тенденция да достигнат наситеното плато), получените показания осигуряват достатъчна дълбочина на секвениране за анализ на таксономичните идентификации. Липсата на промени в индекса на разнообразие на Шанън сочи към хомогенност във видовата оценка на фекалния микробиом сред експерименталните групи (Фигура 1b; стр = .86). Съставът на фекалната микробиота сред експериментални групи на нива тип и клас е показан на Фигура 1в, г, съответно. Бактероидите, Firmicutes и, в по-малка степен, Actinobacteria, Fibrobacteres и Synergistetes са най-разпространеният вид, идентифициран в експерименталните групи в това проучване (Фигура 1д). На ниво клас най-многобройни са както следва: Bacteroidia, Flavobacteria, Sphingobacteria, Cytophagia, Actinobacteria, Fibrobacteria, Clostridia, Erysipelotrichi, Negativecutes и Bacilli (Фигура 1д).

прием

3.3 Диетата с високо съдържание на захар и редовното обучение по плуване оформят микробиома на различни таксономични нива

В това проучване бяха идентифицирани 59 вида, 59 клас, 114 ордена, 244 семейства и 610 род. Независимо от това, само няколко таксономични нива са значително променени. Значителните промени в относителното изобилие на отделни таксономични нива между експерименталните групи в проучването са представени на фигури 2-6-2-6. На ниво филум (Фигура 2), диетата с високо съдържание на захар намалява изобилието от актинобактерии (стр

На ниво клас (Фигура 3), изобилието от фибробактерии е повлияно от диетата (стр

4. ДИСКУСИЯ

Това проучване разкри, че приемът на диета с високо съдържание на захар и редовното обучение по плуване предизвикват динамични промени във фекалната микробиота на плъхове. По-точно, открихме, че затлъстяването, предизвикано от консумацията на диета с високо съдържание на захар, дълбоко променя състава на чревната микробиота, променяйки степента на изобилие от таксони, свързани с развитието на патологии като затлъстяването. Обучението обаче успя да обърне обезогенния ефект, предизвикан от диетата с високо съдържание на захар и да възстанови степента на изобилие на тези модифицирани таксони до съвместими нива на тези животни, подложени на стандартна чау диета. Обучението, свързано с консумацията на стандартната диета с чау, също е полезно за чревната микробиота, увеличавайки степента на изобилие от бактерии, които имат пробиотични ефекти. Подобен ефект от тренировката обаче не се наблюдава при животни, които консумират диета с високо съдържание на захар. Тези открития показват, че редовното физическо упражнение по плуване може да действа положително в чревната микробиота на плъхове, като възстановява променените модели поради високата консумация на захари до нормални нива. Самото обучение обаче не е в състояние да предизвика полезни адаптации в микробиотата за здравето на гостоприемника, в сравнение с връзката му с балансирана диета.

Обучението успя да обърне обезогенния ефект, причинен от диетата с високо съдържание на захар, подобно събитие беше придружено от намаляване на степента на изобилие на таксономични нива, които бяха регулирани от диетата с високо съдържание на захар (Enterobacteriales order, Enterobacteriaceae и Helicobacteriaceae семейства и Ешерихия и Педиокок род). В потвърждение на нашите констатации, други автори наблюдават намаляване на изобилието от бактерии, свързани с вида Proteobacteria при плъхове, подложени на физическа подготовка (състезания с висока интензивност) (Liu et al., 2015; Petriz et al., 2014).

В заключение, нашите резултати показват, че хроничната консумация на диета с високо съдържание на захар води до развитие на затлъстяване и динамични промени във фекалната микробиота при таксони, свързани с метаболитни нарушения, и че редовното обучение по плуване е ефективно за обръщане на такива промени. Редовното обучение по плуване, свързано с балансирано хранене, също предизвиква благоприятни адаптации в микробиотата. Самото обучение обаче не е в състояние да поддържа този профил, като се има предвид консумирането на обезогенна диета с високо съдържание на добавени захари. Следователно, формата на чревната микробиота може да медиира добре познатите полезни ефекти на редовните физически упражнения, свързани с балансирана диета, върху здравето на гостоприемника.

ПРИЗНАВАНИЯ

Настоящото проучване беше подкрепено от Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; номер на безвъзмездна помощ 310733/2014-6), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG; номер на безвъзмездната помощ CBB APQ 02772), Coordenação de Aperfei Pessoal de Nível Superior (CAPES; Финансов код 001) и UFOP.

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ

Всички автори не декларират конфликт на интереси.