Резюме

Заден план

Транс-мастните киселини (TFA) са известни като рисков фактор за заболявания на коронарните артерии, инсулинова резистентност и затлъстяване, придружени от системно възпаление, характеристиките на метаболитния синдром. Малко се знае за ефектите върху черния дроб, индуцирани от липиди, а също така малко изследвания са фокусирани върху ефекта на храни, богати на TFA върху чернодробните функции и оксидативния стрес. Това проучване изследва дали диетите с високо съдържание на мазнини с различни нива на TFA предизвикват оксидативен стрес и чернодробна дисфункция при плъхове.

Методи

Мъжките плъхове Wistar бяха разделени на случаен принцип в четири групи (n = 12/група): C, получаващи стандартна чау; Експерименталните групи, които са били хранени с високо съдържание на мазнини, включват 20% диета с прясно соево масло (FSO), 20% диета с окислено соево масло (OSO) и 20% маргаринова диета (MG). Всяка група е била на лечение в продължение на 4 седмици.

Резултати

Наблюдавано е увреждане на черния дроб при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини чрез увеличаване на чернодробната липидна пероксидация и намалена активност на чернодробните антиоксидантни ензими (супероксиддисмутаза, каталаза и глутатион пероксидаза). Приемът на окислено масло води до по-високи нива на липидна пероксидация и по-ниска концентрация на плазмени антиоксиданти в сравнение с плъхове, хранени с FSO. По-високият възпалителен отговор в черния дроб се предизвиква от MG диета. Чернодробната хистопатология от OSO и MG групи показва съответно умерена до тежка вакуолация на цитоплазмата, хипертрофия на хипатоцитите, балониране на хепатоцити и некроинфламация.

Заключение

Изглежда, че съществува силна връзка между консумацията на TFA в окислените масла и липидната пероксидация и неалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD). Степента на пероксидативните събития в черния дроб също е различна в зависимост от източника на мазнини, което предполага, че храненето с маргарин с по-високи нива на TFA може да представлява пряк източник на оксидативен стрес за организма. Настоящото проучване предоставя доказателства за директен ефект на TFA върху NAFLD.

Заден план

Изследвахме дали диетата с високо съдържание на мазнини (прясно соево масло, окислено соево масло и маргарин) с различни нива на TFA предизвиква оксидативен стрес и NAFLD при плъхове.

Материали и методи

Аналитични определяния на добавените хранителни мазнини

Соево масло и маргарин са закупени в местен супермаркет. Термоксидираното масло се приготвя чрез нагряване на соево масло в сушилня за 24 часа при 200 ° С. Степента на липидно пероксидиране се определя чрез определяне на пероксидната стойност и абсорбцията на UV при 232 и 270 nm (k232 и k270) и р-анизидинова стойност съгласно Европейските официални методи (ЕИО 2568/91) [26]. индексът на окислителна стабилност (OSI) се оценява от апарата на Rancimat (Mod. 743, Metrohm Ω, Швейцария), като се използва масло от 3 g, затоплено до 120 ° C и въздушен поток от 20 L/h [27]. Резултатите бяха изразени като индукционно време в часове на разлагане на хидропероксидите.

Определяне на профила на мастните киселини

Метиловите естери на мастни киселини (FAMEs) от маслените проби се приготвят, както е описано от Issaoui et al. [28]. Отделни FAME се разделят и количествено определят чрез газова хроматография, като се използва инструмент Model 5890 Series II (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA), снабден с пламъчно-йонизационен детектор и стопен силициев капилярен стълб DB-23 (60 m дължина, 0,32 mm id и 0,25 μm дебелина на филма; HP-Agilent Technologies, Wilmington).

Определяне на антирадикалната активност

Капацитетът за извличане на "стабилния" свободен радикал 2,2-дифенил1-1-пикрилхидразил (DPPH) се наблюдава съгласно метода на Рамадан и Морсел [29]. Разтворът се инкубира при стайна температура в продължение на 60 минути и намаляването на абсорбцията при 515 nm се определя след 1, 30 и 60 минути с помощта на UV-видим спектрофотометър (Perkin Elmer Lambda 25).

Лечение на животни

Биохимичен анализ на чернодробните функции

Активността на серумната алкална фосфатаза (ALP) Аспартат трансаминаза (AST), аланин трансаминаза (ALT) и лактат дехидрогеназа (LDH) бяха определени спектрофотометрично с помощта на търговски диагностични комплекти, доставени от Randox Laboratories (Ardmore, Северна Ирландия, Великобритания).

Измерване на нивата на TBARS

Според Buege и Aust [30], липидната пероксидация се изчислява чрез измерване на реактивни вещества с тиобарбитурова киселина (TBARS) и се изразява чрез съдържание на малондиалдехид (MDA). За анализа 125 μl супернатант (S1) се смесват с 50 μl физиологичен разтвор (PBS, PH 7.4), 125 μl 20% трихлороцетна киселина, съдържаща 1% бутилхидрокситолуен и се центрофугират (1000 g, 10 минути, 4 ° С). След това 200 μl супернатант (S2) се смесва с 40 μl HCl (0.6M) и 160 μl трис-тиобарбитурова киселина (120 mM) и сместа се нагрява при 80 ° С в продължение на 10 минути. Абсорбцията е измерена при 530 nm. Количеството TBARS се изчислява, като се използва коефициент на екстинкция 1,56 × 10–5 M -1 cm – 1 и се изразява в nmol MDA/mg протеин.

Измерване на конюгирани диени

Конюгираните диени се определят по метода на Recknagel и Ghoshal [31]. Част от тъканния хомогенат се прехвърля в смес хлороформ/метанол (2: 1). Цялата смес се завихря и центрофугира при 2500 g. Горният слой се измива с хлороформ/метанол/Н20 и се центрофугира. Долният слой се комбинира с първия по-нисък слой и се изпарява под N2. Екстрактът се разтваря повторно в 1 ml циклохексан. Абсорбцията се определя при 233 nm. Използва се коефициент на екстинкция от 2,52 х 104 мола -1. Резултатите са изразени като mmoles mg-1 протеин.

Активност на чернодробните антиоксидантни ензими

Активността на супероксиддисмутазата (SOD) в чернодробния хомогенат се изследва спектрофотометрично, както е описано от Beyer и Fridovich [32]. Този метод се основава на способността на SOD да инхибира окисляването на нитроблуев тетразолий (NBT). Една единица SOD представлява количеството ензими, необходимо за инхибиране на скоростта на окисление на NBT с 50% при 25 ° C. Активността се изразява като единици/mg протеин.

Активността на каталазата (CAT) беше измерена при 20 ° C чрез леко модифицирана версия на метода на Aebi [33]. Разграждането на водородния пероксид (H2O2) чрез CAT ензим се наблюдава кинетично при 240 nm. Коефициентът на моларна екстинкция от 0,043 mM -1 cm -1 се използва за определяне на CAT активността. Една единица активност е равна на микромола H2O2, разграден за минута на милиграм протеин.

Активността на глутатион пероксидазата (GPx) се анализира по метода на Flohe и Gunzler [34]. Активността се изразява като mmol GSH окислен/min/mg протеин при 25 ° С.

Протеинов анализ

Концентрациите на протеини в черния дроб се определят по метода на Брадфорд [35], като се използва говежди серумен албумин като стандарт.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на програмата Статистически пакет за социални науки (SPSS), издание 11.0 за Windows (SPSS, Чикаго, Илинойс, САЩ). Във всеки анализ експерименталните данни представляват средната стойност на 12 независими анализа ± стандартни отклонения. Тестът на Дънкан е използван за определяне на значими разлики между различните групи. Статистическата значимост беше определена на стр

Резултати и дискусия

Аналитични параметри на хранителните мазнини

Аналитичните параметри на използваните хранителни мазнини са показани в Таблица 1. Много е важно да се оцени окислителното разграждане на мазнините и маслата, тъй като инициираното от свободните радикали окисляване е една от основните причини за гранясване на мазнините и маслата, което води до промяна на основните променливи за контрол на качеството като цвят, вкус, аромат и хранителна стойност [36]. Съставът на пробите от термично окислено соево масло (OSO) се различава от прясното соево масло (FSO) с висока стойност на пероксид, конюгирани диени и р-анизидин (Таблица 1) и значително намаляване на окислителната стабилност (3.74 срещу. 0,67 часа) и антирадикален капацитет (93,12 срещу 55,16%), съответно (стр Таблица 1 Средни стойности на състава на мастните киселини (%), параметрите на пероксидация на липидите и антирадикалните свойства на диетата с високо съдържание на мазнини (прясно соево масло, FSO; окислено соево масло, OSO и маргарин, MG)

Що се отнася до състава на мастните киселини (FA), както е показано в таблица 1, FSO и OSO се характеризират с наличието на високи нива на фракция на полиненаситени мастни киселини (PUFA) със значителна (стр 2% в FSO, OSO и MG диети съответно (Фигура 1). В допълнение, изомерният тип също се различава с преобладаване на транс-18: 2 в масла и транс-18: 1 n-9 в MG. В наблюдателни проучвания, използващи биомаркери за консумация на TFA, изглежда, че както изомерите 18: 1, така и 18: 2 допринасят за риска от ССЗ [41].

мазнини

Растеж и хранителен статус на плъхове

Повечето плъхове натрупват постоянно тегло по време на четириседмичното диетично лечение. Средното наддаване на телесно тегло в края на четирите седмици е 16,4 g при контролните животни, 24,55, 20,33 и 25,83 g при FSO-хранени, OSO-хранени и MG-хранени плъхове, съответно (Таблица 2). След четири седмици хранене, телесното тегло, натрупано при плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини, не е статистически значимо (Таблица 2). Ефективността на хранене на плъхове, хранени с диета с OSO, е по-ниска от тази на плъховете, хранени с FSO. Това може да се обясни с факта, че почти всички аминокиселини реагират с първични и вторични продукти на окислени липиди, като по този начин намаляват храносмилателната употреба на протеини, аминокиселини и мазнини, което може да повлияе на наддаването на тегло [42]. От друга страна, резултатите показват, че FSO диетата значително увеличава абсолютното чернодробно тегло в сравнение с контролната група. Не са наблюдавани обаче значителни промени за групите OSO и MG (Таблица 2).

Биохимични показатели на чернодробната функция

Нивата на плазмени хепатоспецифични ензими като ALP и LDH са значително повишени (стр Таблица 3 Биохимични показатели на чернодробната функция в плазмата в контрола (C) и плъхове, третирани с високо съдържание на мазнини, хранени с диета с прясно соево масло (FSO), окислено соево масло (OSO) и маргарин (MG)

Чернодробна липидна пероксидация

В сравнение с контролната група открихме ясни доказателства за чернодробно липидно пероксидиране на FSO, OSO и MG хранени плъхове, както се съди по значително високото им съдържание на конюгирани диенови продукти (CD), отразяващи началната фаза на липидното пероксидиране.

От друга страна, когато се изследва фазата на разграждане на липидната пероксидация, като се анализират вещества, реагиращи на тиобарбитурова киселина (TBARS), нивата на MDA в групата на FSO, в сравнение с групата С, се увеличават с 26,5% (Фигура 2) Установено е, че TBARS в черния дроб на животни с високо съдържание на мазнини е значително увеличен в сравнение с контролните плъхове (стр Фигура 2

Нашите открития разкриха, че нивата на пероксидация на чернодробните липиди са значително по-високи в групите, хранени с маргарин и OSO, отколкото в групите, хранени с прясно масло. Въпреки това, за групата, хранена с OSO, концентрацията на CD беше значително увеличена съответно с 85% и 36% от тази в групата C и FSO. Резултатите от измерванията на липидната пероксидация потвърждават, че загубата на антиоксидантен капацитет и увеличаването на TFAs в OSO влияят върху чернодробната функция, което предполага, че храненето с окислено масло може да представлява пряк източник на оксидативен стрес за организма. Наблюдава се положителна корелация между нивото на общите TFA в диетата и концентрацията на TBARS в черния дроб на животни с високо съдържание на мазнини (r = 0,84). Беше забелязана и много значима положителна корелация между нивата на CD в черния дроб на плъх и транс PUFA в диетата на плъхове (r = 1,0; стр - радикали и H2O2, който от своя страна образува хидроксилни радикали [58]. Дейностите на SOD и CAT са значително намалени в групата на OSO, отколкото в групата на FSO (стр Фигура 3

Хистопатологични лезии

Хистопатологично чернодробните секции от плъхове, хранени със стандартната диета, показват нормален морфологичен вид (Фигура 4а). Черният дроб на експерименталните групи показва явна разлика от тази на контролната група. В групата, хранеща FSO, началната фаза на NALFD, през която мазнините се натрупват в черния дроб (Фигура 4b, тънка стрелка). и се наблюдава вакуолация на цитоплазмата на хепатоцитите (Фигура 4b, черен триъгълник). Както по-рано съобщава Samuhasaneeto и др. [59], диета със сто процента мазнини причинява мобилизиране на свободна мастна киселина от мастната тъкан и транспортиране в хепатоцитите. Тези резултати са в съгласие с предишни проучвания на ефектите от диетата с високо съдържание на мазнини в индуцирането на ранния стадий на NAFLD [59].

Ефект на диетата с високо съдържание на мазнини с различни транс нива на мастни киселини в хистологията на черния дроб на плъх. Нормален чернодробен хистологичен аспект от контрола (H&E 32 ×). Панел (а) той е съставен от шестоъгълни или петоъгълни лобули с централни вени (CV) и периферни чернодробни триади (HT), вградени в съединителната тъкан. Хепатоцитите са подредени в трабекули, излъчвани лъчисто от централната вена, и са разделени от синусоиди (S), съдържащи клетки на Kuppfer. Черен дроб от експериментални групи (H&E 100 ×): Панел FSO (b): при много хепатоцити се наблюдава умерено натрупване на липиди; OSO панел (b); изобилие от вакуолизация на цитоплазмата и балонирани хепатоцити и MG Panel (e); тежко липидно натрупване в хепатоцити и голям брой балонирани хепатоцити. Вакуолизация на цитоплазмата в паренхиматозните клетки на черния дроб (тънка стрелка), хипертрофирани хепатоцити (черен триъгълник). Черен дроб от групите OSO Panel (d) и MG Panel (f) (H&E 32 ×): микрофотография на дегенерирали хепатоцити и некроза (дебела стрелка).

Заключение

В заключение, окислените хранителни масла, хранени на плъхове в продължение на четири седмици, предизвикват липидна пероксидация в черния дроб в сравнение със същите неоксидирани масла. Изглежда, че съществува силна връзка между консумацията на TFAs в окислените масла и липидната пероксидация. Степента на пероксидативните събития в черния дроб също е различна в зависимост от източника на мазнини, което предполага, че храненето с маргарин с по-високо ниво на TFA може да представлява пряк източник на оксидативен стрес за организма. Настоящото проучване предоставя доказателства за директен ефект на TFA върху чернодробна дисфункция, причиняваща нарушения в чернодробния липиден метаболизъм, които водят до NAFLD, който е ключов компонент на кардиометаболичния синдром. Това предполага, че TFA могат да повлияят на рисковите фактори за ССЗ.