Централна изследователска лаборатория на филиала, Втора болница на университета Дзилин, Чанчун, Китайска народна република

щамовете

Централна изследователска лаборатория на филиала, Втора болница на университета Дзилин, Чанчун, Китайска народна република

Централна изследователска лаборатория на филиала, Втора болница на университета Дзилин, Чанчун, Китайска народна република

Централна изследователска лаборатория на филиала, Втора болница на университета Дзилин, Чанчун, Китайска народна република

Централна изследователска лаборатория на филиала, Втора болница на университета Дзилин, Чанчун, Китайска народна република

Централна изследователска лаборатория на филиала, Втора болница на университета Дзилин, Чанчун, Китайска народна република

  • Йонгчен Женг,
  • Yingli Lu,
  • Jinfeng Wang,
  • Лонгфей Ян,
  • Ченю Пан,
  • Ин Хуанг

Фигури

Резюме

Идентифициране на млечнокисели бактерии

Изолатите LA15, B23 и D17 бяха идентифицирани като Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum и Lactobacillus kefiri, съответно, като се използва API 50CHL тест. 16S рДНК на всеки от 3-те изолати беше секвенирана и организмите бяха идентифицирани чрез подреждане на тези 16S последователности като Lactobacillus acidophilus LA15 (Genbank присъединителен номер KC166236), Lactobacillus plantarum B23 (Genbank присъединителен номер KC166237) и Lactobacillus kefiri D17 ( Генбанк номер за присъединяване KC155629).

Адхезионни свойства

Степента на адхезия към клетки Caco-2 варира в зависимост от тестваните щамове и варира от 6,5 до 13,2% (фиг. 1). В23 показва значително по-добри скорости на свързване от референтния щам LGG. Скоростите на адхезия на щамове LA15 и D17 са значително по-ниски (P Фигура 1. Адхезионна способност на Lactobacillus изолати към Caco-2 епителни клетки в сравнение с референтния щам Lactobacillus rhamnosus GG (LGG).

Представените стойности са средството за трикратно определяне, а различните букви (а, б) представляват значителни разлики (Р Таблица 2. Тест in vitro на свързаните с холестерола дейности на LAB, изолирани от тибетски зърна кефир.

Прием на храна, наддаване на тегло и хранителна ефективност

Всички плъхове обикновено бяха здрави през целия период на изпитване за хранене. Четирите групи плъхове не показаха значителни (P> 0,05) разлики в наддаването на телесно тегло, приема на храна или ефективността на храната. Това показва, че животните, допълнени с щамове LAB, растат по сходни модели в сравнение с контролата (Таблица 3).

Анализ на липидите в кръвта

Серумните нива на TC, TG, HDL-C и LDL-C в четирите групи са показани на Фигура 2. Плъхове, хранени с диети LA15, B23 и D17, са имали значително (P Фигура 2. Общ холестерол (TC), триглицериди (TG), нива на липопротеин с висока плътност (HDL-C) и нива на липопротеин на холестерол (LDL-C) в серума на плъхове, хранени само с диета с висок холестерол (контрол) или допълнени с различни щамове млечнокисели бактерии (LA15, B23 или D17) за 4 седмици.

Резултатите са изразени като средни стойности ± стандартно отклонение, n = 10. Средствата в една и съща липидна поредица с различни малки букви (a-d) са значително различни (P 0,05). Групи LA15, B23 и D17 имат значително намалено съдържание на чернодробен холестерол в сравнение с контролната група (P 0,05). Концентрацията на фекален холестерол при плъхове, хранени с щамове LAB, значително се е увеличила в сравнение с контролната група (P Таблица 4. Чернодробното тегло и общите нива на холестерол в черния дроб и изпражненията на плъхове, хранени само с високолипидна диета (контрол) или допълнени с различни млечни киселинни бактерии щамове (LA15, B23 или D17) в продължение на 4 седмици.

Екскреции с фекална обща жлъчна киселина

Фигура 3 показва фекалните екскреции на обща жлъчна киселина при плъхове. Общото отделяне на фекална жлъчна киселина е значително (P Фигура 3. Концентрации на фекална холева киселина при плъхове, хранени само с диета с високо съдържание на холестерол (контрол) или допълнени с различни щамове млечнокисели бактерии (LA15, B23 или D17) в продължение на 4 седмици.

Резултатите са изразени като средно ± стандартно отклонение. Средните стойности с различни букви (a, b, c) се различават значително (P Таблица 5. Брой различни щамове млечнокисели бактерии (LA15, B23 или D17) в дванадесетопръстника, йеюнума, илеума, дебелото черво и изпражненията на плъхове.

Микробен анализ

Таблица 6 обобщава микробния популационен състав на фекалните проби на третираната и контролната групи, както се определя от броя на колониите в селективна среда. Общият брой на анаероба е значително по-висок във всяка група, лекувана с LAB, отколкото контролната група. Наблюдавахме значително увеличение на броя на фекалните лактобацили в третираните плъхове в сравнение с това при контролните плъхове за всеки тестван изолат. Обратно, за всяка група, лекувана с LAB, броят на колиформните организми в изпражненията на плъхове значително намалява на ден 28. След 28 дни на приложение, броят на колиформните организми остава стабилен до края на 42 дни.

Дискусия

Счита се, че адхезията и колонизацията на пробиотични бактерии в стомашно-чревния тракт на гостоприемника е съществена характеристика, необходима за постигането на техните ползи за здравето [19]. Всъщност адхезията е предпоставка за колонизация [20], стимулиране на имунната система [21] и антагонистична активност срещу ентеропатогени [22]. В нашето проучване адхезионните способности на B23 към Caco-2 клетките бяха значително по-силни от тези на референтния щам LGG. A15 и D17 показват свързваща способност, подобна на LGG. Въпреки че заключенията, направени от резултатите от in vitro проучванията, не могат да бъдат директно приложени към ситуациите in vivo, преди това е била показана връзка между адхезионната способност и временната колонизация на човешкия чревен тракт [23]. Следователно щамовете LA15, B23 и D17 бяха избрани за опитите за хранене на животни поради техните адхезивни способности.

Важността на оценката на модела на профила на антибиотична резистентност на новите изолати е да се ограничи употребата на пробиотични култури, съдържащи прехвърлими гени на резистентност към антибиотици. В нашето проучване, 3-те избрани щама бяха тествани за чувствителност към 5 антибиотици, принадлежащи към най-клинично значимите класове антибиотици. Тестовете за чувствителност към антибиотици показват, че те са устойчиви на ванкомицин. Тези резултати се очакваха, тъй като е известно, че лактобацилите са естествено устойчиви на ванкомицин; това съпротивление обикновено е присъщо, хромозомно кодирано и не се предава [24], [25]. LA15 също е бил устойчив на тетрациклин и е установено, че съдържа гена tet (M). Според EFSA [26], когато щам на типично податлив вид е устойчив на дадено антимикробно лекарство, се счита, че има придобита резистентност. Придобитата резистентност може да се дължи или на наличието на допълнителни гени (гени, придобити от бактериите чрез придобиване на екзогенна ДНК) или на мутация на местни гени. За да се определи произходът на резистентността, се прилага PCR за търсене на LA15 за наличие на гени tet (L), tet (M) и tet (S), които са хоризонтално прехвърлени гени, свързани с резистентност към тетрациклин [27]. В щам LA15 е открит само ген tet (M) (данните не са показани).

В заключение, успешно идентифицирахме 3 щама Lactobacillus от зърна от тибетски кефир, които показват задоволителни свойства за приложение на пробиотици. Настоящото проучване показва, че анализираните тук щамове Lactobacillus могат да бъдат полезни при производството на млечни храни за потенциални ползи за човешкото здраве. Необходими са по-нататъшни проучвания, насочени към подобряване на технологичните характеристики на пробиотичните щамове и различни свойства на ферментиралите млека чрез оптимизиране на физикохимичните променливи, често използвани на индустриално ниво.

Материали и методи

Тибетски кефирни зърна

Бяха оценени зърната на кефир, събрани от Тибет, Китай. Кефирните зърна се активират чрез добавяне на 20 g зърна към 500 ml стерилизирано мляко и инкубиране при 25 ° С в продължение на 24 часа. Зърната бяха извлечени чрез пресяване и след това бяха повторно инокулирани в прясно мляко и инкубирани при 25 ° С в продължение на 24 часа. Тогава зърната бяха считани за активни и използвани през цялото това проучване.

Изолиране на LAB

10 g аликвотна част от кефирни зърна се суспендира в 90 g стерилен физиологичен разтвор (0,85%) и се хомогенизира със Stomacher (Laboratory Blender Stomacher 400, Seward, UK) за 20 минути. Бяха направени серийни десетични разреждания с помощта на хомогенизирани суспензии на кефирни зърна. Всеки разреден разтвор се разстила върху агар на de Man, Rogosa и Sharpe (MRS) (Difco, Sparks, MD, USA). Плаките се инкубират в анаеробна ракла с AnaeroPack (Mitsubishi Gas Chemical Co., Inc., Токио, Япония) при 30 ° С в продължение на 48 часа. Бактериалните колонии, които се развиват върху плочите, са отделно подбрани и нанесени върху свежи MRS плочи от агар чрез разреждане на ивици за получаване на единични колонии; тези колонии се поддържат на MRS агар за незабавна употреба и се съхраняват в 20% глицерол при -80 ° C. Изолатите първо бяха скринирани за каталазна активност и оцветяване по Грам, а само тези, които бяха каталазно-отрицателни и Грам-положителни бяха избрани за по-нататъшни проучвания.

Поносимост към киселина

Всяка клетъчна суспензия от избраните LAB култури се приготвя чрез гранулиране на култури, отглеждани за една нощ (37 ° С) и след това измиване и ресуспендиране в пептонов физиологичен разтвор при концентрация от 10 9 образуващи колонии единици (CFU)/ml. MRS средата, предварително регулирана до рН 2.0 и 3.0, се инокулира с приблизително 10 8 CFU/ml от избрани LAB култури и се инкубира при 37 ° С в продължение на 3 часа. Жизнеспособността се определя с помощта на метода за броене на плаки. Проби от един милилитър се вземат от всяка епруветка за 0, 1, 2 и 3 часа и се гранулират и измиват и се правят десеткратни серийни разреждания с използване на солен разтворител с пептон. Разрежданията се поставят върху MRS агар и се инкубират анаеробно при 37 ° С за 24-48 часа.

Толерантност към жлъчна сол

Разтворите на жлъчната сол се приготвят с използване на прах от волска жлъчка (Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ) при крайни концентрации 0,3%, 0,5% и 1%. За контрол се използва стерилна двойно дестилирана вода без волски жлъчка. Всички разтвори се автоклавират и 10 ml от всеки разтвор се прехвърлят в стерилни епруветки. Клетъчни суспензии, съдържащи приблизително 10 9 CFU/ml, се добавят към всеки разтвор (т.е. 0,3%, 0,5%, 1% и контрола) и се инкубират при 37 ° С в анаеробния гръден кош. След 12 часа инкубация 1 ml от всяка култура се разрежда в стерилна 9 ml аликвотна част от 0.85% физиологичен разтвор. Плаките се инкубират в анаеробния гръден кош при 37 ° С за 24-48 часа.

Идентификация и биохимична характеристика на изолатите

Изолатите бяха идентифицирани с помощта на наличната в търговската мрежа API 50CHL система (Biomerieux S.A., La Balme les Grottes, Франция) и анализ на 16S рРНК генни последователности. Нуклеиновите киселини на всеки изолат се екстрахират с помощта на комплект за пречистване на ДНК (Promega, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Две универсални праймери, 27f и 1492r, бяха използвани за амплифициране на гена 16S rRNA [41]. По-късно ампликоните бяха секвенирани (Bioasia Co. Шанхай, Китай) и сравнени с тези, открити в базата данни на Националния център за биотехнологична информация (NCBI). След това 16S последователностите бяха предоставени на NCBI.

Анализи на адхезия in vitro

Изпитване за чувствителност към антибиотици

Минималните инхибиторни концентрации (MIC) на гентамицин, тетрациклин, еритромицин, ванкомицин и хлорамфеникол (Sigma, St. Louis, MO, USA) бяха определени за всеки щам, като се използва процедурата, описана по-горе [43]. Според FEEDAP [44], граничните стойности на MIC за гентамицин, тетрациклин, еритромицин, ванкомицин и хлорамфеникол са съответно 8 µg/ml, 8 µg/ml, 4 µg/ml, 4 µg/ml и 4 µg/ml. PCR-базирано откриване на гените, отговорни за резистентността към хлорамфеникол [catpIP501], тетрациклин [tet (L), tet (M), tet (S)], еритромицин [erm (B), erm (C)], ванкомицин (vanA и vanB) и гентамицин [aac (6 ') - aph (2') - Ia] се прилага върху щамове, за които се предполага, че носят гени на резистентност към антибиотици. Праймери и протоколи са тези, описани от Maietti et al. [45].

Дейности, свързани с холестерола

Културите бяха скринирани за активност на хидролаза на жлъчна сол (BSH) чрез забелязване на 10 µl култура, отглеждана в MRS бульон, върху BSH скринингова среда, състояща се от MRS агарни плочи, допълнени с 0,5% (w/v) натриева сол на TDCA (тауродеоксихолева киселина, Calbiochem, САЩ и Канада) и 0,37 g CaCl2/l [46]. Плочите бяха инкубирани анаеробно в анаеробен буркан (Difco, САЩ) при 37 ° С и активността на BSH беше определена полуколичествено чрез измерване на диаметъра на зоните за валежи. Анализът се извършва в два екземпляра. Асимилацията на холестерола in vitro се определя чрез отглеждане на клетки при 37 ° C в MRS бульон, допълнен с 0,5% w/v TDCA и 0,1 g водоразтворим холестерол/l. След инкубация, бактериалните клетки бяха събрани чрез центрофугиране (2000 х g за 5 минути) и след това супернатантата и не инокулираният контролен MRS бульон бяха изследвани за тяхното съдържание на холестерол, съгласно метода на Mathara et al. [47]. Съвместното утаяване на холестерол с холева киселина се определя въз основа на разликата между нивата на холестерола в контролата (инокулиран бульон MRS без жлъчка) преди и след инокулирането на бульон MRS, допълнен с натриев гликохолат.

Декларация за етика

Това проучване е проведено в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния здравен институт на САЩ (NIH Publication No. 85–23, ревизиран 1996 г.). Експерименталните протоколи са одобрени от Комитета за етичен преглед на научните изследвания на Университета в Дзилин (Номер на разрешение: 2010–069). Всички операции бяха извършени под анестезия на натриев пентобарбитал и бяха положени всички усилия за минимизиране на страданието. Не са необходими специфични разрешения за тези експерименти и теренните проучвания не включват застрашени или защитени видове.

Групи животни и диети

Анализ за измерване на серумни липиди

Плъховете на гладно през нощта бяха обезкървени от опашната вена под натриева пентобарбитална анестезия на 28-ия ден от периода на изследването. Приблизително 1 ml кръв се взема от всеки плъх, прехвърля се в нехепаринизирани епруветки за събиране на вакуум и се държи на лед за 30 минути. След това епруветките бяха центрофугирани при 2000 × g в продължение на 20 минути при 4 ° С. Общият холестерол в серума (TC), липопротеиновият холестерол с висока плътност (HDL-C), липопротеиновият холестерол с ниска плътност (LDL-C) и триглицеридите (TG) се измерват с търговски комплекти (Biosino Biotechnology and Science, Пекин, Китай).

Анализи за чернодробен и фекален холестерол

След евтаназия черният дроб на плъховете се отстранява, изплаква се с физиологичен физиологичен разтвор, попива се на сухо и се претегля. След като чернодробни и фекални проби бяха извлечени с разтворител хлороформ-метанол (2∶1), концентрациите на холестерол в черния дроб и фекалиите бяха определени с помощта на същите комплекти, използвани за определяне на нивата на серумния холестерол [48]. Измервани са нивата на фекална холева киселина, използвайки публикувани методи [49].

Микробен анализ

По различно време след сонда със щамове Lactobacillus (дни 0, 28 и 42), плъховете са били умъртвявани чрез анестезия с Ketamine-HCl. Тънкото черво и дебелото черво се отстраняват асептично и 1 грам от всяка проба се прехвърля в епруветка с 9 ml 0,9% разтвор на NaCl и се хомогенизира чрез завихряне за 10 минути преди разреждане и култивиране върху Rogosa agar (Oxoid). Изолирането и идентифицирането на колониите се извършва съгласно стандартни микробиологични методи, както е описано по-горе.

Статистически анализ