Рик Хърсел

1 Катедра по човешка биология, Училище по хранене и транслационни изследвания в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия,

Евелин А. П. Мартенс

1 Катедра по човешка биология, Училище по хранене и транслационни изследвания в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия,

Hanne K. J. Gonnissen

1 Катедра по човешка биология, Училище по хранене и транслационни изследвания в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия,

Хенрике М. Хамер

2 Катедра по науки за човешкото движение, Училище за хранене и транслационни изследвания в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия,

Джоан М. Г. Сенден

2 Катедра по науки за човешкото движение, Училище за хранене и транслационни изследвания в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия,

Luc J. C. van Loon

2 Катедра по науки за човешкото движение, Училище за хранене и транслационни изследвания в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия,

Margriet S. Westerterp-Plantenga

1 Катедра по човешка биология, Училище по хранене и транслационни изследвания в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия,

Замислени и проектирани експерименти: RH HMH LJCL MSW-P. Изпълнява експериментите: RH EAM HJKG. Анализирани данни: RH EAM HJKG. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: HMH JMGS LJCL. Написа хартията: RH LJCL MSW-P.

Свързани данни

Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Резюме

Заден план

Въз основа на контролирани 36-часови експерименти, по-високият прием на протеини в храната причинява положителен протеинов баланс и отрицателен баланс на мазнините. Положителният нетен баланс на протеини може да подпомогне натрупването на маса без мазнини. Налични са обаче малко данни за въздействието на по-продължителните промени в обичайния прием на протеини върху метаболизма на протеините в цялото тяло и степента на синтез на белтъчния мускулен протеин.

Обективен

За оценка на промените в обмена на протеини в цялото тяло и скоростта на синтеза на базален мускулен протеин след 12 седмици адаптация към нисък спрямо висок хранителен прием на протеини.

Методи

Проведено е рандомизирано паралелно проучване при 40 пациенти, които са спазвали или високо протеинова (2,4 g протеин/kg/d) или нископротеинова (0,4 g протеин/kg/d) енергийно балансирана диета (30/35/35% или 5/60/35% енергия от протеини/въглехидрати/мазнини) за период от 12 седмици. Избрана е подгрупа от 7 мъже и 8 жени (индекс на телесна маса: 22,8 ± 2,3 kg/m 2, възраст: 24,3 ± 4,9 y), за да се оцени въздействието на продължителната адаптация към висок или нисък прием на протеин върху метаболизма на протеини в цялото тяло и нивата на синтеза на базален мускулен протеин. След диетата субектите получават непрекъснати инфузии с L- [пръстен-2Н5] фенилаланин и L- [пръстен-2Н2] тирозин в състояние на гладно за една нощ, като се вземат кръвни проби и мускулни биопсии за оценка на пост-абсорбиращото цяло тяло обмен на протеини и скорости на синтез на мускулен протеин in vivo при хората.

Резултати

Въведение

Диетите с високо съдържание на протеини привличат интерес от много години поради способността им да запазват маса без мазнини (FFM) по време на отрицателен енергиен баланс [1, 2]. Докато е в неутрален или положителен енергиен баланс, временно увеличаване на хранителната консумация на протеини в продължение на 3 месеца може да доведе до увеличаване на FFM [3, 4], особено когато се комбинира с редовни упражнения [5]. Следователно, временно увеличаване на приема на протеини с храната може да действа като превантивна мярка, за да остане теглото стабилно [6]. Въпреки това, въздействието на продължителната адаптация към нисък или висок прием на протеини върху протеиновия баланс на цялото тяло или синтеза на мускулен протеин (MPS) не е оценено. Увеличението на протеиновия синтез, придружено от едновременно намаляване на разграждането на протеина, поради увеличената консумация на протеин, може да бъде отговорно за запазването или увеличаването на FFM, независимо от енергийния баланс.

Материали и методи

Субекти

адаптация

Субектите бяха набирани чрез реклами в местни вестници и на табла за обяви в университета. Набирането на субекти започна през ноември 2012 г. и проучването беше проведено между януари 2013 г. и септември 2013 г. Субектите бяха подложени на скрининг и всички бяха в добро здраве, непушачи, не използваха лекарства (с изключение на орална контрацепция) и употребяващи алкохол с умерена употреба (9), тъй като оценен чрез валидиран холандски превод на въпросника за три фактора за хранене [17]. Утвърденият холандски превод на въпросника за Baecke Activity беше използван за измерване на обичайната физическа активност [18]. Всички процедури, включващи човешки субекти в това проучване, които бяха извършени с подгрупа от субекти от основното проучване [15], бяха специално одобрени от Медицинския етичен комитет на Медицинския център на Университета в Маастрихт. Това проучване също е проведено в съответствие с насоките, залегнали в Декларацията от Хелзинки. Всички субекти предоставиха писмено информирано съгласие. Основното проучване [15] е регистрирано на клиничен триал.гов с идентификатор> NCT01551238. Протоколът за това изпитание и поддържащият контролен списък CONSORT са на разположение като допълнителна информация; вижте S1 Protocol и S1 CONSORT Checklist.

Уча дизайн

Изследването е имало рандомизиран, единично заслепен, паралелен дизайн и се е състояло от дългосрочна (12 седмици) диетична интервенция. Субектите бяха разделени на случаен принцип в две групи, които получиха или HP (2,4 g протеин/kg/ден, 30/35/35% енергия от протеини/въглехидрати/мазнини) или LP енергийно балансирана диета (0,4 g протеин/kg/d, 5/60/35% енергия от протеини/въглехидрати/мазнини).

маса 1

ΔHPLPTotalP-Стойност
N (M/F) 9 (4/5)6 (3/3)15 (7/8)
Възраст (Y) 23,9 ± 4,225,0 ± 6,224,3 ± 4,90,686
Височина (m) 1,70 ± 0,081,70 ± 0,091,70 ± 0,090,899
Тегло (кг) 62,8 ± 6,167,3 ± 8,665,1 ± 7,10,312
Δ Тегло (кг) +0,71 ± 0,8+0,06 ± 1,2+0,45 ± 0,980,216
ИТМ (kg/m 2 ) 22,1 ± 2,423,3 ± 2,222,6 ± 2,30,373
Δ ИТМ (kg/m 2 ) +0,26 ± 0,30+0,04 ± 0,39+0,17 ± 0,340,903
FM% 24,2 ± 7,322,7 ± 7,823,6 ± 7,30,339
Δ FM (%) +0,04 ± 1,31+0,32 ± 0,97+0,15 ± 1,160,672
FFM% 75,8 ± 7,377,4 ± 7,876,5 ± 7,30,709
Δ FFM (%) -0,04 ± 1,31-0,32 ± 0,97-0,15 ± 1,160,672
PAL 1,82 ± 0,141,79 ± 0,151,81 ± 0,140,677

Δ се променя за 12 седмици. ИТМ, индекс на телесна маса; FM, мастна маса; FFM, маса без мазнини; PAL, ниво на физическа активност. Тези данни се отнасят до анализираната популация, а не до рандомизираната популация. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SD. Данните бяха анализирани с еднопосочен ANOVA. Таблица, адаптирана и модифицирана от Martens et al. [15].

Биомаркер за прием на протеини и 24-часов белтъчен оборот

Екскрецията на азот се използва като биомаркер за прием на протеини (за измерване на съответствието) и за оценка на 24-часовия белтъчен оборот. Субектите са събирали 24-часовата си урина в пет различни часови точки през периода от 12 седмици. Събирането започна след първото изпразване сутринта в 0800h и продължи до следващия ден в 0800h, включително първото изпразване. Записва се общият обем на 24-часовата урина. Урината се събира в 2-литрови бутилки за урина с 10 ml разредена солна киселина (4 mmol/L), за да се предотврати загубата на азот чрез изпаряване. Урината внимателно се смесва и се вземат проби и се съхраняват при -20 ° C до анализ. Концентрациите на азот се измерват с азотен анализатор (CHO-O-Rapid; Hereaus). 24-часовият белтъчен оборот се изчислява, като се използва предписания прием на протеин и се измерват данните за екскрецията на азот в урината.

Тестов ден

3 cm под входа през фасцията, чрез използване на техниката на перкутанна биопсия на иглата [22]. Мускулните проби се разрязват внимателно и се освобождават от всякакъв видим немускулен материал. Мускулните проби незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при –80 ° C до допълнителен анализ.

Анализ на плазмата

Плазмените концентрации на глюкоза (Uni Kit III, 07367204; Roche) се анализират с полуавтоматичен анализатор COBAS-FARA (Roche). Инсулинът се анализира с помощта на радиоимуноанализ (Insulin RIA kit; LINCO Research Inc). Плазмата (100 ml) за аминокиселинни анализи се депротеинизира върху лед с 10 mg суха 5-сулфосалицилова киселина, смесва се и бистрата супернатанта се събира след центрофугиране. Концентрациите на аминокиселини в плазмата се определят с помощта на HPLC след дериватизация преди колона с о-фталдиалдехид [23]. За измервания на обогатяване на плазмата, плазмените Phe и Tyr бяха дериватизирани до техните производни на t-бутилдиметилсилил и анализирани с помощта на газова хроматография-масспектрометрия (GC-MS) (Agilent 6890N GC/5973N MSD; Agilent) чрез използване на подбран йонен мониторинг на маси 336 и 341 за немаркиран и етикетиран (пръстен-2 Н5) Phe, съответно; и маси 466, 468 и 470 за немаркиран и етикетиран (пръстен-2 Н2 и пръстен-2 Н4) Tyr, съответно [24]. След това съотношенията на етикетирани: немаркирани производни бяха анализирани с помощта на газова хроматография – масово спектрометрично съотношение на изотопното горене (FinniganMAT 252; ThermoFisher Scientific). При всички анализи на изотопно обогатяване бяха приложени стандартни регресионни криви, за да се оцени линейността на масспектрометъра и да се контролира загубата на следа.

Мускулен анализ

За измерване на обогатяването на L- [пръстен-2 H5] Phe в пула от аминокиселини без мускулна тъкан и смесен мускулен протеин, 55 mg мокри мускули бяха лиофилизирани. Колагенът, кръвта и други немускулни влакнести материали бяха отстранени от мускулните влакна под светлинен микроскоп. Масата на изолираните мускулни влакна (10–15 mg) се претегля и се добавят 8 обема (8 пъти сухо тегло на изолирани мускулни влакна х съотношение мокро: сухо) ледено студена 2% перхлорна киселина. Тъканта се хомогенизира и центрофугира. Супернатантната течност се събира и обработва по същия начин като плазмените проби, така че обогатяването на L- [пръстен-2 H5] Phe без тъкани може да бъде измерено чрез използване на техните производни на t-бутилдиметилсилил върху GC-MS.

Протеиновата утайка се измива с 3 допълнителни промивки от 1,5 ml от 2% хлороводородна киселина, изсушава се и се хидролизира в 6 mol/L HCI при 120 ° C за 15–18 h. Хидролизираната протеинова фракция се изсушава под поток от азот, докато се нагрява до 120 ° С, и се добавя 50% разтвор на оцетна киселина и хидролизираният протеин се прекарва върху Dowex обменна смола (AG 50W-X8, 100-200 меша водородна форма; Biorad) чрез използване на 2 mol/L NH4OH. Елуатът се събира и L- [пръстен-2Н5] Phe се дериватизира до N-метил-N-трет-бутилдиметилсилилтрифлуороацетамидфенилетиламин [25]. След това съотношенията белязани: немаркирани производни се определят с помощта на GC-MS. Стандартни регресионни криви бяха приложени за оценка на линейността на масспектрометъра и за контрол на загубата на индикатор.

Изчисления

Интравенозната инфузия на L- [пръстен-2Н5] Phe и L- [пръстен-2Н2] Tyr и артериализирана проба от кръв са използвани за оценка на метаболизма на цялото тяло в стационарно състояние. Общата скорост на появяване на Phe (Ra) беше изчислена с помощта на модифицирани уравнения на Steele [26, 27]. Тези променливи бяха изчислени, както следва:

където F е интравенозната инфузионна скорост на инфузия (μmol/kg/min), pV (0,125) е обемът на разпределение за Phe [27]. C (t) е средната концентрация на Phe в плазмата между две последователни времеви точки. dE iv/dt представлява зависимите от времето вариации на обогатяване на плазмен Phe, получени от интравенозния индикатор, а E iv (t) е средното обогатяване на плазмен Phe от интравенозния индикатор между 2 последователни времеви точки. Общо Ra представлява плазменото навлизане на Phe, получено от разграждането на протеини в цялото тяло. Общата скорост на изчезване на Phe (общ R d) се равнява на скоростта на конверсия на Phe-to-Tyr (първият етап в окисляването на Phe) и използването за протеинов синтез. Тези променливи бяха изчислени, както следва:

където PheRd и TyrRa са скоростите на потока за Phe и Tyr, съответно; E t (t) и E p (t) са средните плазмени обогащения съответно на L- [пръстен-2Н2] Tyr и L- [пръстен-2Н5] Phe; и F p е скоростта на вливане на Phe трасера. FSR (в%/h) се изчислява, като се използва методът на предшественика-продукт [24]:

където ΔE p е Δ нарастването на свързан с мускулен протеин L- [пръстен-2 H5] Phe по време на периода на включване. E предшественикът е средното обогатяване на плазмен L- [пръстен-2 H5] Phe през периода от време за определяне на включването на аминокиселини и t показва интервала от време (h) между биопсиите.

Статистически анализ

BCAA, аминокиселини с разклонена верига; EAA, незаменими аминокиселини; АА, аминокиселини. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SEM. Данните бяха анализирани с еднопосочен ANOVA.

Фигура 2В показва времевия ход на обогатяването на плазмен L- [пръстен 2 Н5] фенилаланин. Обогатяването с плазмен L- [пръстен 2 H5] фенилаланин е значително по-високо в групата с LP в сравнение с групата с HP (P Фиг. 3 . Синтезът на протеини в цялото тяло, отразен чрез използване на Phe и изразен като средната стойност на общия Phe Rd минус степента на превръщане на Phe в Tyr, е значително по-висок в групата с HP (38,9 ± 4,2 μmol Phe/kg/h, 95% CI: 36,1–42,0; P 2 H5] Обогатяването на Phe между първата и втората биопсия не се различава между групата HP и групата LP (0,0094 ± 0,0023 срещу 0,0101 ± 0,032 MPE; P = 0,395).

Очевидно данните за задържане на азот трябва да се тълкуват с много внимание, когато се използват като прокси за промени в метаболизма на цялото тяло или мускулния протеин. Ясно е, че е необходима повече работа, за да се оцени дали поддържането на пост-абсорбционен баланс на протеини в цялото тяло и скоростта на синтеза на базален мускулен протеин са придружени от промени в (синтеза на мускулите) протеин при хранене [33].

Въпреки че не възнамеряваме да оценим потенциалните различия между половете в базалния белтъчен баланс и честотата на MPS на гладно, забелязахме разлики по отношение на протеиновия баланс на цялото тяло и смесените нива на синтез на мускулен протеин между мъже и жени. Въпреки малкия брой мъже и жени, нашите данни показват, че пост-абсорбиращият синтез на протеини в цялото тяло и мускулите е по-голям при жените в сравнение с мъжете след корекция за разлики в масата без мазнини. Изглежда, че това е в съответствие с някои [34], но със сигурност не всички изследователи, които обикновено не успяват да открият големи различия между половете по отношение на степента на синтез на пост-абсорбционен мускулен протеин [35–38].

В заключение, продължителната адаптация към ниския хранителен прием на протеини намалява нивата на обмен на протеини на гладно, но не компрометира пост-абсорбционния нетен баланс на протеини в цялото тяло. Пост абсорбционните нива на синтеза на скелетни мускули се поддържат дори когато се консумира диета с много нисък прием на белтъчини (0,4 g/kg/ден).