Резюме

Диабетът тип 2 и дислипидемията са често срещани метаболитни нарушения и тяхното разпространение в световен мащаб е изправено пред рязко нарастване, включително предвидена епидемия при диабет, като броят на хората с диабет се очаква да се удвои, достигайки до 300 милиона до 2025 г. (1). Диабет тип 2 и дислипидемия са по-често свързани помежду си, отколкото случайно, което сочи към възможен общ механизъм (механизми) в тяхната етиология (2). От клинична гледна точка дислипидемията при пациенти с диабет тип 2 има няколко характеристики: преобладаване на остатъчни частици и малки плътни LDL и повишаване на плазмените триглицериди, особено в постпрандиално състояние, както и нисък HDL холестерол (3). Те са силно атерогенни и по този начин предразполагат пациентите с диабет към атеросклеротично заболяване, като коронарна артериална болест и инсулт, което не само представлява 70% от смъртността при пациенти с диабет, но също така поставя социална и икономическа тежест в много страни ( 2–7). Следователно терапевтичните стратегии, които са полезни и за двете състояния, са силно оправдани.

инсулинова

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Аналитични процедури за определяне на фенотип.

Хистологично изследване на черния дроб и панкреаса.

Замразените участъци от черния дроб, оцветени със Судан III, бяха изследвани с помощта на флуоресцентен микроскоп с програмен софтуер за анализ на изображения, IPLab Spectrum (Scanalytics), а зоната, оцветена със Судан III, беше количествено определена в четири полета от всяка проба. Парафиновите участъци на панкреаса се оцветяват с хематоксилин-еозин по стандартния метод. Масата на островчетата е определена количествено в осем островчета от всяка проба от BZ-анализатор (Keyence, Осака, Япония).

Измерване на концентрацията на жлъчна киселина и липиди във фекалиите.

Фекалиите се събират в продължение на 48 часа по време на 3-5 дни на диета с високо съдържание на мазнини или съдържащ колестимид при NSY мишки на 20-седмична възраст (n = 6 мишки на група). Фекалиите бяха изсушени и прахообразни, а фекалните жлъчни киселини бяха извлечени от 100 mg прахообразни изпражнения с 90% етанол, съгласно метода на Tokunaga et al. (21); извлечените разтвори се използват за ензимно определяне на концентрацията на жлъчна киселина, като се използва комплект от общи жлъчни киселини (Wako, Osaka, Япония). Общо липиди се екстрахират от 500 mg прахообразни изпражнения с хлороформ/метанол (2: 1 об./Об.), Съгласно метода на Folch et al. (22). Екстрахираните общи фекални липиди се определят гравиметрично.

Подготовка на РНК и анализ на нивото на експресия.

Статистически анализ.

Всички резултати са изразени като средни стойности ± SE. Фенотипните данни са анализирани статистически чрез t тест на Student или еднопосочен ANOVA с post hoc анализ, използващ Scheffe’s F тест. Разлики с P −1 · ден −1; P -1 - ден -1, което предполага, че намаляването на телесното тегло при лечение с колестимид не се дължи на намален прием на храна. Диетата, съдържаща колестимид, се понася добре и не се наблюдава видим неблагоприятен ефект. Единствените очевидни наблюдавани фенотипни промени са предотвратяване на затлъстяването, увеличаване на приема на храна и увеличаване на количеството изпражнения.

Концентрациите на серумен холестерол и триглицериди се подобряват чрез смола, свързваща жлъчната киселина.

В проучването за превенция серумните концентрации на общ, VLDL и LDL холестерол са значително по-ниски при мишки с колестимид, отколкото при тези без 15-седмична възраст (фиг. 2). В интервенционното проучване VLDL холестеролът показва значително намаляване, а общият и LDL-холестерол показват тенденции към намаляване на мишките с колестимид в сравнение с тези без след 5 седмично лечение (фиг. 2А). HDL холестеролът не се различава сред групите. Серумните концентрации на триглицериди, VLDL триглицериди и LDL триглицериди в групата за превенция са значително по-ниски от тези в контролната група (фиг. 2В). Интервенционната група показва тенденции към намаляване на общия триглицерид и VLDL триглицеридите в сравнение с контролната група (фиг. 2В).

Мазният черен дроб и натрупването на мазнини се подобряват чрез смола, свързваща жлъчните киселини.

Чернодробното тегло е значително намалено от лечението с колестимид и в двете групи за превенция и интервенция (Таблица 1). Хистологичният анализ на черния дроб показва значително намаляване на зоната на Судан III в групите за превенция (69%) и интервенция (41% намаление) в сравнение с контролната група, което показва значително подобрение на мастния черен дроб чрез лечение с колестимид (Таблица 1 и онлайн приложение Фиг. 1 [достъпно на http://diabetes.diabetesjournals.org]).

Теглото на подкожните мазнини беше значително намалено в превантивната група и интервенционната група показа тенденция към намаляване. Теглото на висцералните мазнини (ретроперитонеална, мезентериална и епидидимална мазнина) и теглото на НДНТ не се различават значително между трите групи (Таблица 1). При хистологично изследване на адипоцити от висцерална мастна тъкан и НДНТ, размерът на клетките и натрупването на липидни капчици не се различават значително между групите (онлайн приложение Фиг. 3).

Инсулиновата резистентност и нарушената секреция на инсулин се подобряват чрез смола, свързваща жлъчните киселини.

На 20-седмична възраст контролните мишки показват изразена хипергликемия, но това е значително и значително отслабено от лечението с колестимид както в превантивната, така и в интервенционната група (Таблица 1). Нивото на серумния инсулин на гладно е значително по-високо в контролната група, което предполага инсулинова резистентност в тази група (Фиг. 3А). Прилагането на колестимид значително атенюира хиперинсулинемията както в превантивната, така и в интервенционната група (фиг. 3А). За допълнително потвърждаване на ефекта на колестимид върху инсулиновата резистентност е извършен тест за инсулинова толерантност. Понижаващият глюкозата ефект на инсулина е значително нарушен в контролната група, което потвърждава изразена инсулинова резистентност в тази група (фиг. 3В). Понижаващият глюкозата ефект на инсулина беше значително подобрен от лечението с колестимид както в превантивната, така и в интервенционната група (фиг. 3В), което показва, че инсулиновата чувствителност се подобрява от колестимид. За да се изследва възможният принос на адипонектин за подобряването на инсулиновата чувствителност, беше измерена плазмената концентрация на адипонектин. Концентрацията на адипонектин в плазмата не се различава значително между трите групи (Таблица 1).

За допълнително изясняване на ефекта на колестимид върху метаболизма на глюкозата и секрецията на инсулин е извършен орален тест за толерантност към глюкоза. Нивото на кръвната захар на 120 минути след перорално приложение на глюкоза е значително по-ниско в превантивната група, отколкото в контролната група (фиг. 3С); това в интервенционната група показва тенденция към намаляване и е междинно между това в превантивните и контролните групи. Инсулиновият отговор на глюкозата беше напълно премахнат в контролната група, което показва значително нарушен инсулинов отговор на глюкоза в тази група (фиг. 3D). Инсулиновият отговор към глюкозата се подобрява чрез лечение с колестимид както в превантивната, така и в интервенционната група (фиг. 3D). Взети заедно, тези данни показват, че както инсулиновата резистентност, така и нарушената инсулинова секреция са подобрени чрез лечение с колестимид (Таблица 1 и Фиг. 3). Хистологичното изследване на панкреатичните островчета показва, че увеличената площ на островчетата в контролната група е значително намалена при лечение с колестимид в превантивната група (39% намаление) (Таблица 1). Зоната на островчетата в интервенционната група не се различава значително от тази в контролната група.

Екскрецията на липиди в фекалиите се увеличава от смола, свързваща жлъчните киселини.

Намаляването на наддаването на телесно тегло без намаляване на приема на храна при мишки, лекувани с колестимид, предполага възможността колестимид да има намалена абсорбция на енергия, по-специално абсорбция на липиди. За да изследваме тази възможност, измерихме фекалната екскреция на жлъчни киселини и липиди. Фекалната екскреция на жлъчните киселини се увеличава ∼3,5 пъти от лечението с колестимид, което показва, че колестимидът е погълнат успешно от мишките и упражнява биологичния си ефект като смола, свързваща жлъчната киселина (фиг. 4А). Фекалната екскреция на липиди се увеличава около седем пъти при мишки с колестимид (фиг. 4В), което показва, че колестимид значително намалява абсорбцията на липиди от червата.

Експресия на гени, свързани с метаболизма на липидите и глюкозата в черния дроб.

За да се изяснят молекулярните механизми, лежащи в основата на метаболитните промени чрез лечение с колестимид, бяха изследвани експресионните профили на гените, свързани с липидния и глюкозния метаболизъм в черния дроб. Както се очаква, нивото на иРНК на CYP7A1, ограничаващия скоростта ензим на катаболния път на холестерола, беше увеличено около четири пъти при мишки с колестимид в сравнение с тези без (Фиг. 5). Нивото на иРНК на SHP, репресор за транскрипцията на CYP7A1, е значително намалено при мишки с колестимид. Нивото на иРНК на FXR, ядрен рецептор за жлъчни киселини и регулатор на SHP, не се различава значително между трите групи. Нивото на иРНК на SREBP-1c, основен регулатор на липогенни гени, е намалено при мишки с колестимид в сравнение с тези без. Промените в експресията на SREBP-1c бяха успоредни с тези в експресията на SHP.

За да се изясни механизмът на колестимид за подобряване на затлъстяването на черния дроб и серумния липиден профил, бяха изследвани нивата на експресия на гените, участващи в биосинтеза и β-окислението на мастни киселини. Нивото на иРНК на FAS, ключов ензим за синтеза на мастни киселини и известен също като таргет за SREBP-1c, е значително намалено в превантивната група и има тенденция да намалява в интервенционната група (фиг. 5). Експресията на CPT-1, ключов ензим за β-окисление на мастни киселини, не се различава значително между трите групи. Нивото на експресия на PEPCK, ключов ензим за глюконеогенеза, е значително по-ниско в превантивната група, отколкото в контролната група (Фиг. 5). Нивото на експресия на PEPCK в интервенционната група показва тенденция към намаляване и междинна стойност между това в групите за превенция и контрол.

ДИСКУСИЯ

Лечението с колестимид намалява натрупването на липиди в черния дроб и подкожната мастна тъкан, но не и във висцералната мастна тъкан. Диета с високо съдържание на мазнини значително увеличава подкожните мазнини (съответно 2,52 ± 0,24 срещу 4,24 ± 0,23 g за стандартна диета спрямо диета с високо съдържание на мазнини), но не и висцерална мазнина (съответно 3,06 ± 0,19 срещу 2,82 ± 0,07 g), което показва че приложението на колестимид намалява натрупването на мазнини в органите, засегнати от диета с високо съдържание на мазнини, т.е. в черния дроб и подкожните мазнини. Тези данни, заедно със значителни промени в плазменото ниво на адипонектин от лечението, предполагат, че фактори, различни от висцералната мастна маса, са играли роля за подобряване на затлъстяването и инсулиновата резистентност от колестимид, поне в модела на мишката, използван в настоящото проучване. Наблюдаваното в това проучване значително подобрение на затлъстяването на черния дроб може да е отговорно за това. Натрупването на редица доказателства както при животински модели (23,24), така и при хора (25,26) предполага тясната връзка на мастния черен дроб с инсулиновата резистентност и диабета. Съобщава се, че намаляването на натрупването на липиди в черния дроб намалява чернодробната инсулинова резистентност и нормализира глюконеогенезата при пациенти с диабет тип 2, без да променя периферния метаболизъм на глюкозата (25).

Въпреки благоприятния ефект на жлъчните киселини (като холова киселина и хенодеоксихолева киселина) върху глюкозния, липидния и енергийния метаболизъм (29, 30, 33), употребата на жлъчни киселини при хората е ограничена поради токсичните странични ефекти, особено при черния дроб и повишаване на LDL холестерола чрез инхибиране на активността на LDL рецепторите (37). Благоприятният ефект на смолите, свързващи жлъчните киселини, както се наблюдава в настоящото проучване, заедно с тяхната добре установена безопасност и ефикасност при лечението на хиперхолестеролемия при хора, показват потенциалното използване на този вид лекарства за лечение не само на хиперхолестеролемия, но също и затлъстяване, инсулинова резистентност и диабет. Необходими са рандомизирани контролирани клинични проучвания, за да се изясни ефикасността и безопасността на този вид лекарства върху глюкозния, липидния и енергийния метаболизъм при хората.

В заключение, настоящото проучване показа, че колестимид, свързваща смола с жлъчна киселина, подобрява не само дислипидемията, но и затлъстяването, инсулиновата резистентност и диабет тип 2 чрез потискане на SHP, плейотропен регулатор на метаболитните пътища. Тези данни предполагат тясна връзка между метаболизма на жлъчните киселини и метаболизма на глюкозата, вероятно чрез SHP, и сочат към нова терапевтична цел за лечение на затлъстяване, инсулинова резистентност и диабет тип 2. По-нататъшни проучвания за инсулиновата сигнализация и за загуба или увеличаване на функцията на SHP в чувствителни към инсулин тъкани, както и проучвания в други животински модели, биха предоставили допълнителна представа за механизмите, чрез които колестимид подобрява инсулиновата резистентност и диабета. Предвид добре установената ефикасност и безопасност на свързващите смоли на жлъчните киселини при лечението на хиперхолестеролемия при хора, клиничните проучвания за ефикасността и безопасността на този вид лекарства при лечение на затлъстяване, инсулинова резистентност и диабет са оправдани.