Свързани данни

Резюме

Въведение

Резултати

Рапамицин има тенденция да намалява телесното тегло при високочестотна диета

Три групи мъжки мишки на диета с високо съдържание на мазнини бяха лекувани от i.p. инжекции със следните периодични схеми: R1 - 1,5 mg kg -1 три пъти седмично през седмица; R2 (седмична схема) - 1,5 mg kg -1 седмица -1; и R3 - 0,5 mg kg -1 три пъти седмично през седмица (фиг. (фиг. 1). 1). Тези групи мишки са били хранени с високочестотна храна в продължение на 3 месеца преди началото на настоящото проучване (експериментални процедури, предистория). Така че в началото на лечението и трите лечебни групи са били със затлъстяване (фиг. (Фиг. 1) 1) и са били подобни на контролната група с високочестотна диета (сравнете теглата на седмица 0 на фиг. Фиг. 1). 1). Когато това лечение започна (фиг. (Фиг. 1), 1), имаше преходно намаляване на абсолютното телесно тегло в три групи, лекувани с рапамицин (фиг. (Фиг. 1). 1). За разлика от това контролните мишки на диета с високо съдържание на мазнини продължават да наддават, докато достигнат плато след 8 месеца (фиг. (Фиг. 1 1 и фиг. S1, подкрепяща информация). До края на експеримента мишки от група R2 показа тенденция да тежи по-малко от контролните HF мишки (фиг. (фиг. 1). 1). Налице е статистически значимо, макар и преходно намаляване на увеличаването на теглото в група R2 в сравнение с контролната група HF (фиг. S1, посочена подкрепяща информация от звездички).

приложение

Седмично телесно тегло по време на експеримента. Абсолютни телесни тежести. Деветмесечните мъжки мишки бяха разделени на пет групи: мишки с ниско съдържание на мазнини (LF) и четири групи с високо съдържание на мазнини (HF): нелекувана контрола (HF), R1 - 1,5 mg kg -1 рапамицин три пъти/седмица през седмица; R2 група - 1,5 mg kg -1 на седмица всяка седмица и R3 група - 0,5 mg kg -1 на три пъти седмично през седмица. Лечението продължава 11 месеца и теглото се измерва всяка седмица. Горен панел - представени са средни тегла за всяка група. Долен панел - показани са схеми на схеми на лечение с рапамицин и снимки на представителни мишки от контролни групи с ниско съдържание на мазнини и високо съдържание на мазнини.

Рапамицин удължава продължителността на живота при затлъстели мъжки мишки

Анализът на общата преживяемост на отделни групи, лекувани с рапамицин, спрямо контролни мишки с HF разкрива, че седмичното лечение с рапамицин (график R2) значително предотвратява заболеваемостта и смъртта при затлъстели мъжки мишки на HF диета (фиг. (Фиг. 2А). 2А) Докато 60% от контролните мишки на диета с високо съдържание на мазнини са умрели или са били жертвани поради заболеваемост, всички мишки от групата R2 са оцелели. (Причината за смъртта не винаги е била определяна, така че ние не предоставяме тези данни). Имаше висока статистически значима разлика (P = 0,0063) в общата преживяемост на мишките в група R2 в сравнение с контролната HF група (фиг. (Фиг. 2А). 2А). Степента на преживяемост и на трите групи, лекувани с рапамицин, взети заедно за анализ, също е значително по-висока в сравнение с контролната HF група (P = 0,028, фиг. Фиг. 2В). 2Б). По този начин се постига значимост за група R2 и за трите получени рапамицин групи, взети заедно, спрямо групата с HF. Редуващи се двуседмични лечения (групи R1 и R3) показват тенденция към увеличаване на преживяемостта, но това не е статистически значимо (фиг. S2, подкрепяща информация).

Рапамицин удължава живота на мишките на диета с високо съдържание на мазнини (HF). (А). Крива на степента на преживяемост по Kaplan – Meier за контролни мишки на HF диета (HF; n = 10) и мишки, лекувани с рапамицин, следвайки схема R2 (HF + рапамицин (група R2); n = 9). (Б). Крива на степента на преживяемост по Kaplan – Meier за контролни мишки на HF диета (HF; n = 10) и всички групи мишки, лекувани с рапамицин (всички групи), взети заедно (n = 28).

Нива на p-S6 при оцелели мишки

След единадесет месеца лечение, когато 60% от мишките от HF контролната група умряха, експериментът беше спрян, за да се изследват оцелелите мишки. И в трите групи, лекувани с рапамицин, мишките бяха умъртвени 8 дни след последното лечение, за да се елиминират преките ефекти на рапамицин върху изследваните параметри. Ние фокусирахме изследването върху сърцето и черния дроб. Предишни доклади сочат към сърцето (сърдечния мускул) също като много важна тъкан за измерване на фосфо-S6 (Hua et al., 2011; Leontieva et al., 2012a, 2013b; Ramos et al., 2012; Flynn et al ., 2013; Wu et al., 2013; Zhou et al., 2013). Сърцето е един от най-често изследваните органи при стареене, а лечението с рапамицин подобрява състоянието на сърцето. Освен това сърдечно-съдовите заболявания са най-честата причина за смърт при хората. Важно е, че предишните ни проучвания включват сърдечния фосфо-S6 като потенциален маркер за дълголетие и хипертрофия на животните (Leontieva et al., 2013b) (Leontieva et al., 2012a; Flynn et al., 2013).

В R2 групата нивата на сърдечния p-S6 са статистически по-ниски, отколкото в контролната HF група (Фиг. (Фиг. 3). 3). P-S6 отразява активността на mTORC1, за която е известно, че участва в стареенето. Също така измерихме фосфорилирането на AKT при S473, което отчасти е маркер на активността на mTORC2. За разлика от p-S6, p-AKT (S473) не е намален в група R2 (Фиг. (Фиг. 3 3)).

p-S6 в сърцето на оцелелите мишки. (А). Имуноблот анализ на протеинови лизати от сърцето на мишки на диета с ниско съдържание на мазнини (LF) или с високо съдържание на мазнини (HF): контрол (HF - нелекуван) или третиран с рапамицин (представена група R2 - HF/R2). Извършва се имуноблотинг с посочените антитела. Цифрите показват отделни мишки. (Б). Количествен анализ на данните, показани на фиг. Фиг. 3А. 3А. Количествените интензитети на p-S6 сигнал (ляв панел) и сигнал на p-AKT (Ser473) (десен панел) представени като средно ± SE.

Ние също оценихме тези параметри в черния дроб. В съгласие нивата на чернодробния p-S6 са значително по-ниски в групата R2 в сравнение с HF контрола. Подобно на сърцата, чернодробните нива на p-AKT (S473) имат тенденция да бъдат по-високи в групата R2, въпреки че не достигат статистическа разлика в този конкретен тест (фиг. (Фиг. 4). 4). Забележително е, че нивата на p-S6 и p-Akt в бъбреците не се различават в контролните и лекуваните с рапамицин групи и p-S6 и p-Akt силно корелират (фиг. S4, подкрепяща информация).

p-S6 и p-Akt в черния дроб на оцелели мишки. (А). Имуноблот анализ на протеинови лизати от черния дроб на

2-годишни мъжки мишки на диета с високо съдържание на мазнини (HF): контрол (HF - нелекуван) или лекуван с рапамицин (представени групи R2 и R3 - HF/R2, HF/R3). Цифрите показват отделни мишки. Равното натоварване беше потвърдено и чрез оцветяване на мембраната с Commassie Blue (Фиг. S3, Допълнителна информация). (Б). Количествен анализ на данните, показани на фиг. Фиг. 4А. 4А. Количествените интензитети на p-S6 сигнала и сигнала на p-AKT (Ser473) са представени като средна стойност ± SE.

Третираните седмично мишки не са имали метаболитни отклонения

Метаболитни параметри при оцелели мишки. Теглата и метаболитните параметри (лептин, IGF1, триглицериди, глюкоза и инсулин) се определят в плазма на гладно и се представят като средно ± SE. Натрупаната кръв се събира сутрин след гладуване през нощта.

Дискусия

Тук демонстрирахме за първи път, че рапамицинът удължава живота на затлъстелите мишки на диета с високо съдържание на мазнини (HF). Значително увеличение на преживяемостта е постигнато чрез периодично приложение на рапамицин. Най-виден ефект се наблюдава при мишки, лекувани веднъж седмично. Всички мишки от тази (R2) група оцеляват до края на експеримента. Два други графика на приложение на рапамицин (през седмица: R1 и R3) показват тенденция към намаляване на смъртността, макар и да не е постигната статистическа значимост. Независимо от това, преживяемостта и в трите групи, лекувани с рапамицин (80%), е значително по-висока (P фигура 4C, 4C, нивата на p-S6 на гладно са по-високи при старите мишки, отколкото при младите мишки (Sengupta et al., 2010a). че нивата на p-S6 разграничават спокойствието от стареенето (Blagosklonny, 2012a; Leontieva et al., 2012b), нивата на p-S6 на гладно могат да бъдат потенциален маркер за стареене. Нивата на p-S6 в сърдечния мускул са свързани с размера на тялото и обикновено са по-високи при мъжките, отколкото при женските мишки (Leontieva et al., 2012a). Това е в съгласие с наблюденията, че големите мъже са склонни да живеят по-кратко от женските и малките щамове мишки. Взети заедно, тези данни подкрепят схващането, че пътят mTOR/S6K стимулира растежа и стареенето (Blagosklonny & Hall, 2009).

mTOR се активира от инсулин, IGF-1 и възпалителни цитокини (Zoncu et al., 2011; Cornu et al., 2012), като всички те са маркери за бързо стареене и лошо здраве. Освен това, активираният mTOR/S6K път може да причини инсулинова резистентност (Khamzina et al., 2005; Krebs et al., 2007). Следователно, по-ниските нива на гладно на p-S6 могат да бъдат маркер за по-бавно стареене и метаболитно здраве. Нашето проучване вероятно подценява положителните ефекти на рапамицин, тъй като метаболитните параметри се оценяват само при мишки, оцелели до 2-годишна възраст. Докато всички мишки от група R2 оцеляват до края на експеримента, само 40% мишки оцеляват в контролната група. В контролната HF група мишки с по-кратък живот (по-малко здрави и по-бързо стареене по дефиниция) не оцеляват и по този начин не са включени в изследването на p-S6 и метаболитните параметри.

Това проучване е отправна точка за допълнителна оценка на периодичните графици на рапамицин и за увеличаване на техния потенциал за удължаване на живота чрез модулиране на дозите и честотата. Удължаването на живота чрез интермитентно лечение с рапамицин може допълнително да се усили с диета, антидиабетното лекарство метформин (Anisimov et al., 2011a; Martin-Montalvo et al., 2013) и, ако е възможно, с физически упражнения. Взети заедно, тези условия могат да подобрят здравето и да увеличат продължителността на живота на застаряващите хора.

Експериментални процедури

Всички проучвания върху животни са проведени в съответствие с разпоредбите на Комитета по грижа и употреба на животните към Института за рак на Розуел Парк.

Праистория [предишно проучване (Leontieva et al., 2013c)]: 9-месечни мъжки мишки (щам C57BL/6NCr) бяха разделени на 5 групи: едната група получи стандартна лабораторна чау (5% мазнини, ниско съдържание на мазнини) (LF) диета. Четири други групи са получавали 60% диета с високо съдържание на мазнини (Research Diets, Inc, Cat # D12492 Diet Diet 60% kCal% мазнини; New Brunswick, NJ, USA) (HF) за 3 месеца. Тези четири групи на HF диета бяха, както следва: HF група - контрол (HF), R1 група получи орално ниска доза ресвератрол; R2 група получи орално ниска доза рапамун; и R3 групата получиха комбинация от ресвератрол и рапамун, както е описано по-рано (Leontieva et al., 2013c).

Текущо проучване

Една седмица след приключване на първото проучване, експериментални групи (R1-R3) са лекувани с рапамицин (LC Laboratories) чрез i.p инжекции, съгласно следните графици: R1 група е получавала 1,5 mg kg -1 три пъти седмично/през седмица; R2 групата се инжектира с 1,5 mg kg -1 седмица -1 на седмица; и R3 група се прилага по 0,5 mg kg -1 три пъти седмично/през седмица. Лечението продължава 11 месеца и теглото се измерва всяка седмица. На осмия ден след последното третиране, мишките се гладуват цяла нощ и се жертват. Кръв се събира в края на деня, преди да се отстрани храната за гладно през нощта. На следващата сутрин се събира кръв на гладно и се принасят в жертва мишки. Непостената и гладната плазма бяха подготвени, съответно, за биохимичен анализ.

Рапамицин (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) се разтваря в етанол при 15 mg mL -1 (запас) и след това се разрежда до 0,15 mg mL -1 в PBS, съдържащ 5% Tween-80, 5% PEG 400 и 4% етанол.

Имуноблот анализ

Тъканите се хомогенизират и се извършва имуноблотинг, както е описано по-рано (Leontieva et al., 2012a). Заешки антифосфо S6 (Ser 240/244), антифосфо-AKT (Ser473), общ AKT и анти-S6 бяха използвани от нас, както беше описано по-рано (Leontieva et al., 2012c) и закупени от Cell Signaling Biotechnology (Danvers, MA, САЩ); моноклонални анти-β-актин-пероксидаза (AC-15) и миши анти-GAPDH антитела са получени съответно от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ) и Invitrogen (Grand Island, NY, USA).

Нивата на глюкоза в кръвната плазма са измерени с помощта на ленти Accu-Chek Aviva (McKesson, Atlanta, GA, USA).

Концентрацията на инсулин, IGF1, лептин и триглицериди в кръвната плазма се измерва с помощта на свръхчувствителен ELISA комплект за инсулин (мишка) (ALPCO Diagnostics, Salem, NH, САЩ), комплект ELISA за мишка/плъх (ALPCO), комплект ELISA за мишки Leptin (Crystal Chem Inc, Downers Grove, IL, USA) и Triglyceride Colorimetric Assay Kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA), съответно. Данните бяха анализирани, като се използва диапазон от стандарти и четири параметри логистично приспособяване или линейна регресия.

Статистически анализ

T тест и корелационни анализи [коефициент на Pearson r и стойност P (с две опашки)] бяха извършени с помощта на GraphPad Prism версия 5.00 за Windows, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, САЩ. www.graphpad.com.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от RPCI. Авторите благодарят на Wei Tan за помощта при статистически анализ на оцеляването на мишките.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Финансиране

Тази работа е финансирана от института за рак на Розуел Парк (Бъфало, Ню Йорк, САЩ).

Авторски приноси

OVL изпълнява експерименти, анализира данни и пише статията. GMP изпълнява експерименти и анализира данни. MVB е проектирал изследването, анализирал данни и е написал статията.

подкрепяща информация

Допълнителна поддържаща информация може да бъде намерена в онлайн версията на тази статия на уебсайта на издателя.

Фиг. S1 Процент от първоначалното телесно тегло.

Фиг. S2 Криви на оцеляване по Kaplan – Meier за контролни мишки на HF диета (HF, n = 10) и мишки, лекувани по график R1 (n = 10) и R3 (n = 9).

Фиг. S3 Commassie Синьо оцветена мембрана от чернодробни петна, показана на фигура Фигура 4A 4A, за да потвърди равното натоварване.

Фиг. S4 Нива на p-S6 и p-AKT в бъбреците на оцелелите мишки.

Фиг. S5 Нива на гладно и на гладно глюкоза и инсулин в кръвната плазма на мъжки мишки.

Фиг. S6 Корелация между метаболитните параметри в плазмата на гладно.

Фиг. S7 Криви на оцеляване по Каплан – Майер.

Таблица S1 Крива на оцеляване с високо съдържание на мазнини (HF) и група с високо съдържание на мазнини и рапамицин (група 2) (HF + рапамицин (група 2)).

Таблица S2 Крива на оцеляване с високо съдържание на мазнини (HF) и групи с високо съдържание на мазнини + рапамицин (HF + рапамицин всички групи).