Елена И. Денисова

1 Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск Русия,

секс-специфични

Валерия В. Кожевникова

1 Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск Русия,

Надежда М. Бажан

1 Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск Русия,

2 Катедра по физиология, Новосибирски държавен университет, Новосибирск Русия,

Елена Н. Макарова

1 Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск Русия,

Резюме

Резюме

Прилагането на лептин при бременни мишки временно инхибира скоростта на растеж при плодовете и на двата пола, намалява нивото на мРНК на плацентата GLUT1 само при женските плодове и намалява теглото на плацентата и увеличава скоростта на растеж след отбиване само при мъжки потомци. Специфичният за пола ефект на програмиране на лептина може да бъде свързан с различното му действие върху плацентите на мъжки и женски плод.

Съкращения

Според парадигмата „Развитие на здравето и заболяванията“ здравето на индивида зависи от вътрематочните и ранните постнатални състояния 1. Доказано е, че затлъстяването по време на бременност увеличава риска от метаболитни заболявания при потомството. неизвестно какви фактори от майчината среда предизвикват промени във фенотипите на потомството и механизмите, които медиират дългосрочните ефекти на тези фактори.

Адипоцитният хормон лептин играе ключова роля в регулирането на енергийната хомеостаза 3, а нивата на циркулиращия лептин са пропорционални на мастната маса на тялото 4. Значителен брой проучвания показват, че лептинът участва в програмирането на развитието 5, 6, 7, 8 Защитен ефект срещу затлъстяване при потомството е открит, когато лептин е прилаган през цялата бременност или през втората половина на бременността при плъхове и мишки на стандартна диета 5, 7, 9, 10. Въпреки това, приложението на лептин по време на ранна бременност и в средата на бременността при ограничени с храна мишки е доказано, че увеличават склонността на женските потомци да развиват индуцирано от диетата затлъстяване (DIO) 11. Ефектите от програмирането на лептин вероятно зависят от времето на приложението му, хранителните условия на майката и пола на потомството.

Лептинът може да повлияе развитието на плода чрез въздействието му върху плацентарните функции 12. Плацентата снабдява плодовете с хранителни вещества и растежни фактори, като по този начин определя степента на растеж на плода и теглото при раждане на потомството 13, 14. На свой ред теглото при раждане предсказва бъдещото здраве на индивидуален. При хората тежестите при раждане, които са твърде ниски или твърде високи, са свързани с повишен риск от диабет тип 2 и затлъстяване 15, 16. При мишки е наблюдаван сексуален диморфизъм за плацентарния отговор на затлъстяването по време на бременност 17, 18. Това предполага, че някои свързани със затлъстяването майчини фактори (включително повишен лептин) могат по различен начин да повлияят на функциите на плацентите на мъжки и женски плодове. Не е известно дали майчиният лептин влияе върху скоростта на растеж на плода и експресията на хранителни транспортери и растежни фактори в плацентата в средата на бременността и дали плацентарният отговор на действието на лептина е специфичен за пола.

Целта на настоящото проучване беше да се изследват ефектите от прилагането на лептин върху мишки по време на средата на бременността върху метаболитните фенотипове на потомството, теглото на плода и експресията на гени в плацентите според пола на потомството. Установихме, че приложението на лептин при бременни мишки диференцирано повлиява някои фенотипни черти на мъжкото и женското потомство и този ефект е свързан с временно ограничаване на растежа на плода и специфичен за пола плацентарен отговор на инжекциите на лептин. Предлагаме, че специфичният за пола ефект на програмиране на лептин, прилаган в средата на бременността, може да бъде свързан с различните му действия върху плацентите на мъжки и женски плодове.

Методи

Етично одобрение

Всички експерименти са извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (1996) и руските национални инструкции за грижи и употреба на лабораторни животни. Протоколите са одобрени от Независимия комитет по етика на Института по цитология и генетика (Сибирски отдел, Руска академия на науките).

Диети

Стандартната чау-диета се доставя под формата на гранули и е закупена от Assortiment Agro (Московска област, Тураково, Русия). Обезогенната храна включва сладки бисквити с масло, свинска мас и слънчогледови семки. Животните са получавали обезогенна храна в допълнение към стандартната чау. Животните са получавали излишни количества от всяка храна, включително чау, така че приемът им е бил ad libitum.

Животни

Мишките C57BL/6J бяха закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME, САЩ) и след това бяха отгледани във вивариума на Института по цитология и генетика. Мишките бяха настанени под 12: 12-часов режим светлина-тъмнина (7 часа 30 минути-19 часа 30 минути светлина) при температура на околната среда от 22 ° C. На мишките беше осигурен ad libitum достъп до търговска мишка и вода за мишки.

Женските се чифтосват с мъжките на възраст 10-14 седмици и са настанени поотделно от деня на откриване на копулационен щепсел (гестационен ден 0, GD0). На GD12, женските получават подкожни инжекции от рекомбинантен миши лептин (4,0 µg · g -1 BW), разтворен във физиологичен разтвор до крайна концентрация от 500 µg · ml -1 или инжектирани с физиологичен разтвор (контролен) за 9 h 00 min. Според нашето предишно изследване, лептин, приложен в тази доза на мишки в края на бременността, не е повлиял жизнеспособността на потомството, но това приложение е повлияло фенотип на потомството 5. Приложените лептин и физиологичен разтвор са разделени на три експериментални групи.

В една група 14 лекувани с лептин и 17 лекувани с физиологичен разтвор жени бяха претеглени преди и 24 часа след инжектирането и бяха умъртвени чрез бързо обезглавяване. Бяха събрани проби от кръвта им в ствола и бяха претеглени плодовете и плацентите им. Феталните чернодробни проби бяха събрани и бързо замразени в течен азот за последващо определяне на пола.

Във втората група девет лекувани с лептин и девет третирани с физиологичен разтвор мишки бяха умъртвени 7 часа след инжектирането на лептин, а пробите от всяка плацента и фетален черен дроб бяха замразени бързо в течен азот. Когато бяха открити половете на плодовете, бяха избрани плацентите от шест лекувани с лептин и шест лекувани с физиологичен разтвор, за да се изследва плацентарната генна експресия. Избраните язовири имаха седем до девет плода и два или повече плода от двата пола. Най-леките и тежки плаценти в едно котило бяха изключени от анализа на генната експресия, тъй като беше показано, че размерът на плацентата влияе върху експресията на гени, кодиращи транспортерите на глюкоза и аминокиселини 19.

Третата група се използва за изследване на влиянието на приложението на лептин върху фенотипите на потомството. При раждането малките, родени от девет лекувани с лептин и седем третирани с физиологичен разтвор женски, бяха претеглени, а котилата, съдържащи повече от седем малки, бяха намалени до седем малки. Измерваха се телесните тегла на малките (BW) в следродилни дни 1, 7, 14, 21 и 28. На 28 ден след раждането двама мъже и две жени от всяко котило бяха отделени от майките си и настанени поотделно, а техните BW и приемът на храна (FI) бяха измервани веднъж седмично до 16-седмична възраст. През този период всички животни са хранени със стандартна чау диета ad libitum. От 16-седмична възраст един мъж и една жена от всяко кучило продължават да получават стандартна диета, а един мъж и една жена започват да получават бисквити, свинска мас и слънчогледови семена в допълнение към стандартната чау. Тази смес имитира диетата в кафенето и засилва бързото развитие на затлъстяване при мишки 5. BW на мишки се измерват веднъж седмично в продължение на 8 седмици. Консумацията на обезогенна храна не е измерена. В края на експеримента животните се умъртвяват чрез обезглавяване, събират се проби от кръв и се измерва теглото на коремните мастни накладки.

Материали

Миши рекомбинантен лептин е закупен от PeproTech (Принстън, Ню Джърси, САЩ).

Плазмени анализи

Концентрациите на лептин се измерват с търговски комплекти (лептин: R&D Systems, Минеаполис, Минесота, САЩ, интра-анализ: 3,8–4,3%; интераси: 3,8–5%). Концентрациите на глюкоза в плазмата са измерени с помощта на търговски комплект (Fluitest GLU; Analyticon Biotechnologies, AG 35104, Lichtenfels, Германия).

Относителна количествена PCR в реално време

Определяне на феталния пол

Половете на плодовете са определени с помощта на геномна ДНК PCR със следните праймери: SX_F, 5′ ‐ GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA ‐ 3 ′; SX_R, 5′ ‐ CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA ‐ 3 ′ 20. ДНК е извлечена от плода на черния дроб със солен разтвор според Aljanabi и Martinez (21) 19. Полът е определен при приблизително 85% от плодовете.

Статистически анализ

Резултати

Влияние на приложението на лептин върху язовири върху GD12 върху теглото на майките, техните плодове и техните плаценти

Ефектите на лептина върху теглото на майките, техните плодове и плаценти зависят от времето, изминало след инжектирането. Лекуваните с лептин и физиологичен разтвор не се различават по своите промени в BW (-1,2 ± 0,3%, n = 9; -1,1 ± 0,4%, n = 9; физиологичен разтвор и лептин, съответно), но се различават по теглото на своите плодове в рамките 7 часа след инжектирането. В сравнение с резултатите от прилагането на физиологичен разтвор, прилагането на лептин води до пропорционално намаляване на теглото на мъжките плодове (P (Фиг. 1A, B). 1 A, B). В резултат съотношението на теглото на плода/плацентата стана по-ниско при женските плодове на лекуваните с лептин язовири в сравнение с това на контролните язовири (P = 0,05, вложен дизайн ANOVA, Фиг. Фиг. 1C). 1 С). В рамките на 24 часа след инжектирането, прилагането на лептин намалява печалбата на BW на язовира с 2,35 пъти (Таблица (Таблица 1), 1), но лекуваните с лептин и физиологичен разтвор не се различават по отношение на нивата на лептин и глюкоза в плазмата (Таблица (Таблица1). 1). Вложен дизайн ANOVA не разкрива влиянието на лечението на майката върху теглото на плода или плацентата в рамките на 24 часа след приложението на лептин или физиологичен разтвор както при мъжки, така и при женски плодове (Фиг. (Фиг. 1 1 D-F).

Влияние на приложението на лептин върху язовири върху GD12 върху метаболитните фенотипове на потомството

Потомство BW преди отбиването и FI и BW след отбиването

Прилагането на лептин на язовири на GD12 не е повлияло жизнеспособността или теглото на плода в края на бременността: броят и теглото на новородените малки са били равни при лекуваните с лептин и физиологичен разтвор ядки (Таблица (Таблица 1, 1, Фиг. Фиг.2 2).

Влияние на приложението на лептин върху мишки C57BL върху GD12 върху женски (A) и мъжки (C) потомци BW и женски (B) и мъжки (D) потомци FI след отбиване. Данните са представени като средни стойности ± SEM от 7 стойности за потомство на лекувани с физиологичен разтвор майки и 9 стойности за потомство на лекувани с лептин майки.

Отговор на потомството към обезогенната диета

Обезогенната диета индуцира развитието на затлъстяване както при мъжете, така и при жените (P Фиг. 4A, B), 4 A, B), а пренаталната експозиция на лептин не повлиява значително BWs или BW печалбата на женското и мъжкото потомство. Това приложение на лептин също не повлиява натрупването на мазнини в корема при мъжкото и женското потомство, независимо от диетата (фиг. (Фиг. 5А) 5 А) и премахва наличието на хипергликемия при затлъстели животни. Концентрациите на глюкоза в кръвта са били по-високи при DIO мишки, отколкото при мишките със стандартна диета (SD) за потомството на контролни майки и са били еднакви при DIO и SD мишки, родени от лекувани с лептин майки (двупосочен ANOVA с фактори " диета "и" секс ", фиг. фиг. 5Б). 5 Б). Когато концентрациите на глюкоза бяха анализирани поотделно при мъжете и жените, ефектът на взаимодействие на факторите „лечение на майката“ и „диета“ се наблюдава при жените, но не и при мъжете.

Влияние на обезогенната диета върху промените в BW при възрастни женски (A) и мъжки (B) потомци на мишки, на които е бил прилаган лептин или физиологичен разтвор върху GD12. Данните са представени като средните стойности ± SEM от шест до седем животни във всяка група.

Ефектът от приложението на лептин върху растежа на плодовете вероятно се медиира чрез влиянието му върху плацентарните функции. По-рано в генетичния модел открихме, че повишеното ниво на лептин при A y мишки е придружено от намаляване на теглото както на плода, така и на плацентата 34.

Интересното е, че при A y мишки повишените нива на лептин също са свързани с намалена експресия на Slc2a1 в плацентите само на женски плодове 34. Взети заедно, нашите резултати показват, че повишаването на нивата на лептин в кръвта при мишки в средата на бременността секс - конкретно инхибира експресията на ген, кодиращ GLUT1 в плацентите. GLUT1 е най-често срещаният транспортер на глюкоза в плацентата и регулира както усвояването на глюкозата в плацентата, така и трансплацентарния трансфер на глюкоза към плода 39. Влиянието на индуцираното от лептин инхибиране на експресията на Slc2a1 върху метаболизма на плацентата и трансплацентарния трансфер на глюкоза може да бъде причина за забавяне на растежа при женските плодове. Въпреки че лептинът играе важна роля в плацентарната физиология 40, досега няма доказателства, че лептинът влияе върху експресията на гена Slc2a1 в плацентата. Влиянието на лептин върху експресията на гена Slc2a1 в плацентите вероятно се медиира от някои метаболитни сигнали, генерирани от язовири в отговор на приложението на лептин.

Прилагането на лептин инхибира растежа на плода, без да влияе върху плацентарната генна експресия на Igf1 и Igf2, за които е известно, че влияят върху растежа на плода и плацентарната морфогенеза, транспорта на субстрата и секрецията на хормони 41. Пропорционалното намаляване на теглото както на мъжките плодове, така и на техните плаценти след приложение на лептин предполага, че намаляването на физическия размер на плацентите може да бъде основна причина за забавяне на растежа, индуцирано от лептин при мъжки плодове. Показани са различните ефекти на екзогенния лептин върху теглото на плацентите на мишки в зависимост от етапа на бременността и диетата на майката: лептинът намалява теглото на плода и плацентата при мишки при стандартна диета в края на бременността 32 и увеличава теглото на плацентата при мишки с ограничена храна в началото бременност 42. Нашите резултати са съгласни с наблюдението на Yamashita et al., въпреки че механизмите, лежащи в основата на влиянието на краткосрочното повишаване на лептина в майчината кръв върху плацентарното тегло, са неясни.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Авторски приноси

NMB и ENM замислят и проектират проекта; EID, VVK и ENM са придобили данните; EID, VVK и ENM анализираха и интерпретираха данните; и EID и ENM написаха статията.