Xosé López-Goldar

1 Катедра по екология и еволюционна биология, Университет Корнел, Итака, Ню Йорк, Съединени американски щати

2 Misión Biológica de Galicia (MBG-CSIC), Понтеведра, Галисия, Испания

Лина Лундборг

3 Катедра по химия, Факултет по инженерни науки по химия, биотехнологии и здраве, Кралски технологичен институт (KTH), Стокхолм, Швеция

Анна Карин Борг-Карлсън

3 Катедра по химия, Факултет по инженерни науки по химия, биотехнологии и здравеопазване, Кралски технологичен институт (KTH), Стокхолм, Швеция

Рафаел Зас

2 Misión Biológica de Galicia (MBG-CSIC), Понтеведра, Галисия, Испания

Луис Сампедро

2 Misión Biológica de Galicia (MBG-CSIC), Понтеведра, Галисия, Испания

Свързани данни

Всички съответни данни се намират в ръкописа и в неговите поддържащи информационни файлове.

Резюме

Въведение

Индуцируемостта на защитните сили в отговор на биотични стимули се счита за важна черта в устойчивостта на растенията [21, 22]. Индуцируемите реакции могат да доведат до специфични промени в химичния профил и концентрацията на ключови вторични метаболити, които могат да зависят от идентичността на нападателя [9, 23, 24]. Различията в индуцируемостта на вторичните метаболити сред генотипове, популации или видове могат да обяснят разликите в резистентността срещу враговете [21, 22, 25]. Въпреки непрекъснатите усилия за разбиране на вариабилността на индуцираните реакции на вторичните метаболити и неговото отражение върху биотичната резистентност при иглолистните дървета [вж. Например 26, 27–29], все още е малко известно за това как индуцируемостта на смолистите киселини може да варира в зависимост от тревопасния идентичност и как тези отговори се различават при видовете борове.

Въпреки съществуващата съвкупност от знания за индуцираните защитни сили в боровите дървета, често се пренебрегват системните индуцирани реакции в дисталните части на растението от мястото на увреждането [30, 31]. Биотичното предизвикателство може ефективно да предизвика локални защитни реакции - и да възпрепятства влизането на врага в ранената зона - но също така може да възпрепятства по-нататъшните агресии в дисталните части на растението чрез системно индуцирана резистентност [32] или улеснено чрез свързаната системна чувствителност [30, 33]. Системно индуцираните отговори на иглолистните смолисти киселини са проучени след гъбично увреждане [22], механично нараняване [34] или химическо извличане [35], но системните реакции на тревопасните насекоми остават до голяма степен неизследвани.

Експериментално

Природознание

Фокусирахме се върху два вида борове, които в момента съжителстват в Южна Европа. Морският бор (Pinus pinaster Ait.) Е местен вид на Иберийския полуостров, чието разпространение варира от Южна Франция и Югоизточна Европа до Северна Африка. Борът от Монтерей (P. radiata D. Don) произхожда от Калифорния и е въведен в Испания около 1840 г. В наши дни и двата вида се припокриват в района на Атлантическия океан на Иберийския полуостров в обща надморска височина от 0 до 800 m. а. с. л.

Експериментален дизайн

Проведохме факториален парников експеримент с два основни фактора: видове борове (P. pinaster и P. radiata) и истинско тревопасно третиране за индуциране на растителни защитни сили (контрол, подхранване на борова гъба и хранене на гъсеници). Експериментът е последван от рандомизиран дизайн на разделен участък, възпроизведен в 10 блока, с тревопасно третиране като цялостен фактор и видове борове като разделен фактор. Размерът на пробата е бил общо 60 борови растения (3 индукционни обработки × 2 вида × 10 блока).

Растителен материал

Боровите семена се третират с фунгицид (Fernide®, Syngenta Agro, Испания), за да се избегнат смущения от пагубни патогени и се засяват индивидуално в 2 L саксии, като се използва смес от перлит и торф като субстрат (1: 1, v: v) с 12 g на тор с бавно освобождаване (Multicote®). Разсадът се отглежда в стъклена оранжерия с контролирани светлинни условия (минимум 12 часа на ден) и температура (25 ° C през деня, 10 ° C през нощта) и се полива ежедневно, както е описано в Moreira et al. [9] до навършване на една година (средната височина на бор е била 41,2 ± 2,4 cm за P. pinaster и 62,7 ± 4,0 cm за P. radiata). След това всички растения бяха внимателно покрити с найлонова мрежа, за да се избегне бягство от насекоми, и произволно разпределени за тревопасни третирания (контрол, бор борчест и борова гъсеница).

Третиране на тревопасни растения

Възрастни борови дръвници бяха уловени на полето през лятото на 2009 г. с помощта на капани Nordlander [46], държани в културни камери при 15 ° C и хранени с пресни борови клонки в продължение на две седмици. Преди индукционната обработка на дългоносиците, гладките са гладували в продължение на 48 часа в чашките на Петри с навлажнена филтърна хартия (15 ° С и тъмно) и след това се претеглят. По един екземпляр се поставя върху всеки млад бор, оставя се да се храни в продължение на 5 дни и след това се изважда и претегля отново.

Гнезда с борови гъсеници бяха събрани на полето от нападнати дървета през лятото на 2009 г., транспортирани до лабораторията в ледени охладители, незабавно отворени и ларвите на втората инстанция бяха внимателно разделени. Групи от 10 гъсеници бяха гладувани както по-горе в продължение на 12 часа и претеглени. Две групи от 10 гъсеници бяха поставени с всяко растение, едната върху игли в горната част, а другата в долната част. Гъсениците се оставят да се хранят 6 дни и след това се отстраняват, преброяват и претеглят.

Нито едно насекомо не е умряло през периода на хранене и всички растения са били повредени. Щетите, причинени или от борови дрънчанки, или от гъсеници, не се различават съществено между видовете бор [47].

Вземане на проби и химичен анализ

След третиране на тревопасни растения, всяко растение е събрано чрез нарязване на стъблото на земята. Свеж сегмент на стъблото с дължина 1,5 cm от средната част и произволно избрана проба от игли (приблизително 0,2 g) бяха събрани от всяко растение, претеглени, замразени и консервирани при -80 ° C в криогенни флакони за терпеноидни анализи.

Екстракцията на терпеноиди във флоема и иглите се извършва, следвайки процедурата, описана в Sampedro et al. [48] ​​с модификации. Пробите се смилат фино в тефлонови епруветки с течен азот и терпените се екстрахират чрез използване на ултрачист n-хексан в ултразвукова баня при 25 ° С. Аликвотни части от тези екстракти (500 μl) се изсушават при постоянен поток на N2, позволявайки на моно- и сесквитерпените да се изпарят, а останалите дитерпени и смолисти киселини се ресуспендират в 750 μL метанол, използвайки 0,1 mg · ml -1 хептадеканова киселина (# H3500, Sigma-Aldrich) като вътрешен стандарт. След това дитерпеновите смолни киселини се дериватизират до техните метилови естери със 75 μL тетраметиламониев хидроксид (# 334901, Sigma-Aldrich).

Смолистите киселини в екстрактите са идентифицирани в KTH (Стокхолм, Швеция) чрез газова хроматография-масспектрометрия (GC-MS) в режим на общ йон (TIC) (обхват на сканиране 40–400 m/z). Системата GC-MS се състоеше от Agilent HP6890 GC, съчетана с 5793 MS. Разделянето се извършва върху DB-5 капилярна колона (30 m, т.е. 0,25 mm, дебелина на филма 0,25 μm, Agilent Technologies, CA, USA). Обем от 1 μL от всяка проба се инжектира в режим без разделяне, като се използва хелий като газ-носител със скорост на потока 1 mL · min -1. Програмата на фурната е настроена на 152 ° C за 2 минути, последвана от температурен скат от 3 ° C · min -1 до 260 и се поддържа при тази температура в продължение на 5 минути. Температурата на инжектора е настроена на 250 ° C изотермично. Пиковете, присъстващи във всяка TIC хроматограма (вж. S1 Фиг.), Бяха идентифицирани чрез сравняване на техните спектри с тези в библиотеките NIST и Wiley Mass Spectra, включени в софтуера MSD Enhanced Chemstation софтуер (версия E.02.01.1177, Agilent Technologies, CA, USA ) и в литературата [49], и сравнявайки техните изчислени индекси на задържане с тези, открити в литературата [50].

Смолените киселини се определят количествено в MBG (Понтеведра, Испания) с GC-пламъчен йонизационен детектор (FID) Perkin Elmer Clarus 500, оборудван с капилярна колона Elite-5 (30 m, ID 0,25 mm, дебелина на филма 0,25 μm, Perkin Elmer, MA, САЩ) еквивалентно на предишния DB-5. Всички параметри за разделяне на GC са конфигурирани идентично с предишния анализ при KTH. Като газ-носител се използва водород. FID температурата беше зададена на 300 ° C. Количественото определяне на смолените киселини се извършва чрез използване на калибрационна крива на търговския стандарт на абиетинова киселина (# 00010, Fluka). Индивидуалната концентрация на смолиста киселина се изразява в mg · g -1 сухо тегло (d ww). Делът на екстрахираните смолисти киселини беше най-накрая сравнен с този от предишни изследователски проучвания при същия вид борове (до момента бяха налични само данни за P. pinaster), които използваха подобни или различни разтворители като нашия, като откриха незначителни разлики [21, 51–54] . Това подкрепя надеждността и възпроизводимостта на нашата процедура за екстракция на смолисти киселини.

Наличието на еднозначно идентифицирани смолни киселини в най-малко три проби от индукционната обработка (неповредени контролни групи, бор борчест или борова гъсеница) беше използвано като критерии за подбор преди анализа. Избрани са девет смолни киселини (S2 Фиг.). При аналитичните сепарации две основни смолисти киселини съвпаднаха и бяха обработени като едно съединение (левопимарова + палустринова киселини) в статистическите анализи.

Статистически анализ

За всяко тревопасно насекомо, ефектите от тревопасното третиране върху концентрацията на обща и индивидуална смолиста киселина в стъблото и игличките на всеки вид бор се анализират със смесен модел с ограничена максимална вероятност (PROC MIXED процедура в SAS 9.4, Cary, NC) . Индукционното лечение (T), боровите видове (SP) и тяхното взаимодействие (T × SP) се считат за фиксирани фактори. Блок (B) и взаимодействието (B × T) бяха третирани като произволни фактори, за да се тества основният ефект T с подходящ термин за грешка [55]. Проведени са независими анализи за всяко тревопасно насекомо и всяка тъкан. Бяха проведени и специфични тестове за контраст за всеки вид бор, за да се изследват ефектите на всяко насекомо тревопасно животно в концентрацията на обща и индивидуална смолиста киселина за всяка борова тъкан по отношение на контролните растения. Остатъчната нормалност е постигната чрез лог-трансформация на суровите данни, когато е необходимо, и са използвани хетерогенни модели на дисперсия за фактор Т, когато значително подобрено прилягане на модела. Два случая бяха отстранени поради грешки в извадката. Резултатите са показани като средно най-малко квадратна ± стандартна грешка (напр.).

Многовариантните промени в профила и концентрацията на смолисти киселини между видове, тревопасни третирания и растителни тъкани бяха анализирани чрез анализ на главния компонент, използвайки PROC PRINCOMP в SAS 9.4. Основните смолни киселини бяха обобщени в първите два компонента, които бяха анализирани, за да се тестват ефектите на T, SP и взаимодействието T × SP върху мултивариантния профил на смолистите киселини, като се използва смесеният модел отгоре.

Резултати

Концентрация на общо смолни киселини в отговор на тревопасните

Общата концентрация на смолисти киселини се различава значително между видовете борове и в двете растителни тъкани (Таблица 1). Общата концентрация на смолисти киселини в стъблото е по-висока при P. pinaster, отколкото при P. radiata, докато P. radiata показва по-висока концентрация на смолисти киселини в иглите, отколкото P. pinaster (Фиг. 1). Храненето с борови дългоносици значително повишава концентрацията на общо смолисти киселини в стъблото на двата вида борове (Таблица 1, Фигура 1А), но не и в иглите (Таблица 1, Фигура 1В). Локалната индукция на общите смолисти киселини в стъблото след хранене с дървесни птици е по-голяма при P. pinaster, отколкото при P. radiata (Фиг. 1А). Тези разлики в индуцираната реакция доведоха до незначително значимо взаимодействие между видовете и дълговете за концентрацията на общите смолни киселини в стъблото (таблица 1).

като

Локални и системни ефекти на увреждането от две дъвчащи насекоми тревопасни животни, боровата лъжичка (сиви пръчици, дъвчаща кора) и боровата гъсеница (черни пръчици, дефолиатор) върху общата концентрация на смолисти киселини в флоемата и кората на стъблото (а) и в иглите (б) от борови разсад от два вида. LS означава ± s.e. (N = 9-10). Звездичката над лентите показва значителни разлики с контролните растения във всеки вид (P Таблица 1). Установено е обаче интересно и значимо взаимодействие вид × гъсеница за общите смолни киселини в иглите (Таблица 1). Намаление с 55% на концентрацията на смолисти киселини след хранене с гъсеница в иглите на P. radiata, но не е открит ясен отговор при P. pinaster (фиг. 1В). Специфични контрасти във всеки вид също показват значително системно увеличение на общите смолни киселини в стъблата на P. pinaster след хранене с гъсеница, но липса на отговор при P. radiata (фиг. 1А).

Концентрация на отделни смолисти киселини в отговор на тревопасните

Повече от 95% от общото количество дитерпени в екстрактите на стъблото и игличките от двата вида борове се състоят от смолистите киселини, представени на фигура 2. Пимаринова киселина не е открита в иглите на P. radiata, докато само игли от милирадиенова киселина са открити в иглите на P. radiata (Таблица 2). Статистическите анализи на тези две съединения в иглите бяха ограничени до P. pinaster.

Ефекти от индуцирането на тревопасните растения от борови дългоносици (сиви пръчици) и борови гъсеници (черни пръчици) върху концентрацията на отделни смолисти киселини в флоемата на стъблото и в иглите на два борови вида. LS означава ± s.e. (N = 9-10). Звездичката над лентите показва значителни разлики между тревопасното третиране по отношение на контролните растения за всяко съединение във всеки вид (P 95% от общото количество дитерпени. Показани са съставните концентрации (mg · g -1 сухо тегло, средно ± se) и размер на пробата (n) на всяка смолиста киселина от стъблото и иглите на контролните растения за всеки от видовете борове.

RT: време на задържане.

Концентрациите на всички смолисти киселини в стъблата, с изключение на изопимарна и дехидроабиетинова киселини, са били по-високи в P. pinaster, отколкото в P. radiata (Таблици (Таблици 3A 3A и and 4A, 4A, Фигура 2A и 2B). Иглите на P. radiata показаха по-високи концентрации на всички смолни киселини от иглите на P. pinaster, с изключение на пимаровата, сандаракопимаровата и милирадиеновата киселини (Таблици (Таблици 3B 3B и and 4B, 4B, Фигура 2C и 2D).

Таблица 3

Борови видове Борови дървесни видове Видове × дългоносициDfFPDfFPDfFP
а) Стъбло
Пимарич1,1746.28 Таблица 3). Индуцираните смолисти киселини в стъблото бяха средно 1,4 пъти и 0,6 пъти по-високи, отколкото в съответните контролни растения на P. pinaster и P. radiata, съответно (Фиг. 2А и 2В). Тези количествени разлики в индуцираните отговори между видовете се отразяват в значителни взаимодействия между видовете и дълговете за повечето смолни киселини: пимарова, сандаракопимарова, изопимарова, дехидроабиетична и абиетинова киселини (Таблица 3А). Специфични контрасти показват, че всички съединения са били индуцирани в стъблата на P. pinaster (фиг. 2А), а само дехидроабиетитни и абиетинови киселини са били индуцирани в стъблата на P. radiata след хранене с дългоносици (фиг. 2В). Не са открити значителни взаимодействия между видове и херпели за концентрацията на смолисти киселини в иглите (Таблица 3B). Всички специфични контрасти между контролните растения и индуцираните от дървесни растения показаха, че няма значителен системен ефект от храненето на дървес върху концентрацията на отделни смолисти киселини в иглите на двата вида борове (Фиг. 2С и 2D).

Специфични контрасти показват, че след хранене с гъсеница повечето смолисти киселини значително повишават концентрацията си в стъблото на P. pinaster, но не и на P. radiata (фиг. 2А и 2В). Значителни взаимодействия между видове и гъсеници обаче са открити само за милирадиенова и неоабиетинова киселини в стъблото (Таблица 4А). Нещо повече, обща тенденция за намаляване на смолистите киселини в иглите в отговор на храненето на гъсеница е установена при P. radiata, но не и при P. pinaster (фиг. 2C и 2D), въпреки че взаимодействията между видове и гъсеници са били значими само за дехидроабиетичните и абиетичните киселини (Таблица 4Б). Специфични контрасти показват значително намаляване на концентрацията на сандаракопимарова (-72%), изопимарова (-43%) и дехидроабиетинова киселини (-48%) след захранване с борови гъсеници в иглите на P. radiata в сравнение с контролните растения (фиг. 2D). Слаби отговори бяха открити в иглите на P. pinaster. Пимаровата киселина беше единствената, която показа значително намаление (-39%) за този вид след тревопасната борова гъсеница (фиг. 2С).

Многовариантни промени в профила и концентрацията на смолисти киселини в отговор на тревопасните

а) Графично представяне на променливите натоварвания за всеки компонент; б) химичен профил и концентрация на смолисти киселини в многовариантното пространство, изобразено от борови видове, тревопасни обработки и растителни тъкани (цветни граници на символи и ленти за грешки: червено = флоема на стъблото, синьо = игли). Всеки символ и ленти за грешки представляват средната стойност на PC1 и PC2 и съответно техните стандартни грешки за всяка комбинация от борови видове, тревопасни третирания и растителни тъкани (N = 9–10 растения). Обясненията на отклоненията (в%) и собствената стойност (Ev) на всеки компонент са посочени в скоби. Abi = абиетични, Deh = дехидроабиетични, Iso = изопимарични, Lev + Pal = левопимарични + палустрични, Neo = неоабиетични, Pim = пимарични, San = сандаракопимарични, Mil = милирадиенични.