Департамент по биологични науки, Висше училище по наука, Университет Хирошима, Хигаши Хирошима, Япония

Катедра по радиология, MSB F ‐ 451, Университет по медицина и дентална медицина в Ню Джърси — Медицинско училище в Ню Джърси, 185 S. Orange Avenue, Newark, NJ 07103‐2714 Търсене на още статии от този автор

Институт по повърхностна химия, Киев, Украйна

Институт по повърхностна химия, Киев, Украйна

Институт по повърхностна химия, Киев, Украйна

Катедра по химична физика, Университет "Мария Кюри-Склодовска", Люблин, Полша

Департамент по биологични науки, Висше училище по наука, Университет Хирошима, Хигаши Хирошима, Япония

Департамент по биологични науки, Висше училище по наука, Университет Хирошима, Хигаши Хирошима, Япония

Катедра по радиология, MSB F ‐ 451, Университет по медицина и дентална медицина в Ню Джърси — Медицинско училище в Ню Джърси, 185 S. Orange Avenue, Newark, NJ 07103‐2714 Търсене на още статии от този автор

Институт по повърхностна химия, Киев, Украйна

Институт по повърхностна химия, Киев, Украйна

Институт по повърхностна химия, Киев, Украйна

Катедра по химична физика, Университет "Мария Кюри-Склодовска", Люблин, Полша

Департамент по биологични науки, Висше училище по наука, Университет Хирошима, Хигаши Хирошима, Япония

Резюме

Заден план

Полиморфните форми на силициев диоксид (силициев диоксид; SiO2) взаимодействат с клетъчните мембрани на много клетки на бозайници, включително червените кръвни клетки (RBC), причинявайки хемолиза. Електростатичният фактор, който се смята за основен фактор за контакта на силициево-клетъчната материя, може да има потенциален интерес за изследване на свойствата на клетъчната повърхност. Интерес представляват и повърхностните свойства на частиците SiO2.

Методи

Измитите човешки еритроцити взаимодействат с частиците от силно диспергиран димящ силициев диоксид (Aerosil A-300) и силициеви диоксиди (девет проби), получени от първоначалния A-300 чрез неговото дехидроксилиране при различни термични условия. Техният разсейване на светлината (разпръскване на светлина напред и странично) в 0,01% разтвор на силициев диоксид се измерва непрекъснато в рамките на първите 5 минути от реакцията чрез поточна цитометрия (поточна еритрограма). Хемолитичният ефект на частиците SiO2 е оценен чрез фотометрично измерване на хемоглобина в супернатантата 90 минути след реакцията.

Резултати

Разсейването на светлината на засегнатите еритроцити и степента на хемолиза разкриват, че повърхностните свойства на частиците SiO2 имат различни ефекти върху еритроцитите. След термично намаляване на повърхностните хидроксилни групи мембранотоксичният ефект на силициевия диоксид се увеличава и след това намалява.

Заключения

Въпреки че хората и други живи същества са се развили в тяхната среда (теория за еволюцията), някои фактори на околната среда могат да бъдат вредни и да доведат до развитието на много заболявания. Например замърсяването на въздуха с частици изостря болестите при хора с респираторни заболявания и увеличава броя на смъртните случаи от сърдечно-съдови и респираторни заболявания, особено сред възрастните хора (1). Според Паолети (2) фино диспергираните минерални частици достигат до алвеолите и остават там години наред, без да губят химичните си свойства. Смята се, че химичните свойства на частиците и клетъчните повърхности допринасят главно за контакта частица-клетка, което е неизбежно и необходимо за развитието на болестта. Изследването на взаимодействието между клетката и неорганичните мембранофилни вещества (например микрочастици от силициев диоксид) е един от проблемите на мембранната биология. Силицият, който допринася за развитието на силикоза, белодробно заболяване, се среща в редица полиморфни форми (3). Аморфните силициеви киселини вероятно са по-малко опасни от кристалните силициеви киселини (4).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Проби от силициев диоксид

Девет проби от силициев диоксид бяха получени от първоначалния Aerosil A ‐ 300 (Kalush, Украйна; Проба 1, синтезирана при нестандартни условия, за да се намали количеството вода, адсорбирана молекулярно и дисоциативно [24]) с 0,57% вода чрез нагряване при различни температури (т; 200–900 ° C) за тт = 10–180 минути в атмосферата (Таблица 1) .1

Температура на пробите (° C) Време (мин)
2 200 25
3 200 60
4 200 85
5 200 180
6 600 60
7 600 150
8 900 10
9 900 20.
10 900 120

Димният силициев диоксид A-300, синтезиран при стандартни условия, се характеризира с по-голямо количество адсорбирана вода до 5 тегловни процента. Разтворът на силициев диоксид се приготвя чрез добавяне на 5 mg сух силициев прах към 25 ml (w/v) буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.0 mM Na2HPO4, pH 7.3). За да се дезагрегират по-големите частици към частиците на субмикронно ниво, суспензията е подложена на ултразвукова обработка (Branson Sonifier модел 450; Branson Ultrasonics, Danbury, CT) в 50-милилитрови пластмасови тръби, заобиколени от лед при изходна мощност 20 W за 5 минути . Преди реакцията с червените кръвни клетки, 0,5 ml аликвотна част от разтвор на силициев диоксид се разрежда в 1,0 обем PBS (крайна концентрация на силициев диоксид е 0,01%).

Реакционна смес от силициев еритроцит

Десет микролитра от еритроцитната маса от здрав доброволец се промива три пъти в PBS при 300 х g за 5 минути при стайна температура. 70 µl аликвотна част от RBC суспензията, съдържаща 2 × 106 клетки се добавя към силициев разтвор и внимателно се разбърква. Като контрола, червените кръвни клетки се добавят към 1 ml PBS.

Оптични измервания

Разсейването на светлината, т.е. разсейването напред (FSC) и 90 ° странично разсейване (SSC), на клетките, взаимодействащи със силициев диоксид, се записва непрекъснато през първите 5 минути от реакцията2 на потоков цитометър FACSCalibur (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, Сан Хосе, Калифорния), оборудван с 15-mW аргонов йон лазер (488 nm). Сигналите FSC и SSC бяха събрани в линеен режим. Пробите бяха анализирани при настройка на (средна) скорост на потока от 35 ± 5 μl/min. 3 Анализът на данните беше извършен със софтуера CellQuest (Becton Dickinson). Клетъчните остатъци и агрегати бяха елиминирани от анализа.

Когато беше достигната 90-минутна точка на инкубация, 4 еритроцитите бяха центрофугирани при 300 × g за 5 минути при стайна температура. Количеството освободен хемоглобин се определя фотометрично в супернатанта при 405 nm на четец за микроплаки MPR ‐ A4i (Тосон, Япония).

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Нагряването на димен силициев диоксид до 1000 ° C в продължение на няколко дни не променя морфологията на рояци от първични частици, които остават аморфни (16). Тази твърда обработка обаче може да промени специфичната повърхност (С) и обема на порите в инертни материали поради дехидратация с отстраняване на повърхностните и насипни хидроксили (3, 15-17). Въпреки че нагряването на димния силициев диоксид в широк температурен диапазон (200–900 ° C) варира тт засяга неговите структурни свойства, свързани както с микропорите, така и с мезопорите и тези промени могат да бъдат двусмислени и нелинейни по отношение на С срещу т и тт, броят на повърхностните хидроксили корелира с температурата на термичната обработка (3, 15-17).

Фигура 1 представя степента на хемолиза, оценена чрез фотометричното измерване на хемоглобина в супернатантата, който се освобождава чрез 90 минути инкубация на 2 × 106 еритроцити с 0,01% силициев диоксид. След повишаване на температурата и времето на термична обработка на A-300 до съответно до 600 ° C и 150 минути, силициевият диоксид (проби 2–7) показва постепенно нарастване на хемолитичната активност. Въпреки това, след последващо увеличаване на термичната обработка, особено повишаване на температурата до 900 ° C, силициевият диоксид (проби 8-10) демонстрира леко намаляване на неговия мембранотоксичен ефект.

чрез

Хемолитичен ефект от 0,01% силициев диоксид (проби 1–10) върху 2 × 106 еритроцити след 90 минути взаимодействие на силициево-клетъчни клетки. Оптичните плътности (O.D.) на освободения хемоглобин бяха определени в два екземпляра и техните стойности бяха осреднени. O.D. стойност от 0,015 е представителна за контролната проба (спонтанен лизис). Проби 6 и 7 имат най-голям хемолитичен ефект и причиняват 88% клетъчен лизис. Интересното е, че проба 3 причинява повече хемолиза от проба 4. Два независими експеримента с хемолиза показват сходни резултати.

FSC спрямо SSC контурни графики, показващи реакция на еритроцитите към силициев диоксид през първите 5 минути след добавяне на 2 × 106 клетки към 0,01% силициев диоксид (проби 1–10). Стрелките показват най-големите количества клетъчни остатъци, причинени от частиците SiO2 в проби 6 и 7.

Насложете FSC хистограмен анализ на червените кръвни клетки, отговарящи на силициев диоксид през първите 5 минути след добавяне на 2 × 106 клетки до 0,01% силициев диоксид (проби 1–10).

Сравнителен анализ на FSC (A) и SSC (Б.) сигнали, събрани от еритроцитите през първите 5 минути след добавяне на 2 × 10 6 клетки към 0,01% силициев диоксид (проби 1–10). Тъй като засегнатите клетки се характеризират с изкривени FSC разпределения, стойностите на FSC сигналите се изразяват като средни номера на каналите, за да покажат централна тенденция. Стойностите на SSC ​​сигналите се изразяват като средни номера на каналите.

Карта на FSC спрямо SSC на популациите от еритроцити, реагиращи на силициев диоксид през първите 5 минути след добавяне на 2 × 10 6 клетки към 0,01% силициев диоксид (проби 1–10). Стойностите на FSC и SSC сигналите се изразяват съответно като средни и средни номера на каналите. Разпределението на клетъчните популации, засегнати от силициев диоксид, в зависимост от температурните условия, при които е обработен Aerosil A ‐ 300, е показано с различни символи (отворен квадрат, 200 ° C; удебелен отворен квадрат, 600 ° C; затворен квадрат, 900 ° C).

Ние заключаваме, че данните, представени в това проучване, показват, че червените кръвни клетки реагират на силициев диоксид по специфичен за пробата и неслучайно начин. Поради готовата наличност и високата чувствителност към външни фактори, еритроцитите предлагат удобен и информативен модел за сондиране на повърхностните свойства на силициев диоксид. Методът на поточната еритрограма, предложен в това проучване, позволява лесни и точни средства за анализ на клетъчните отговори в началната фаза на взаимодействие на силициево-клетъчни клетки. Смята се, че този метод предоставя основа за новата система за анализ, с която да се изследват повърхностите на силициев диоксид и евентуално повърхностите на други вещества от интерес.

Благодарности

Богдан И. Геращенко е благодарен за стипендията „Монбушо“, предоставена от Министерството на образованието, науката и културата на Япония.