J. W. A. ​​M. Bosmans

1 Катедра по обща хирургия, Медицински център на Университета в Маастрихт, P.O. Box 5800, 6202 AZ Маастрихт, Холандия

2 NUTRIM училище за изследване на храненето и превода в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

A. C. H. M. Jongen

1 Катедра по обща хирургия, Медицински център на Университета в Маастрихт, P.O. Box 5800, 6202 AZ Маастрихт, Холандия

2 NUTRIM училище за изследване на храненето и превода в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

B. T. C. Boonen

1 Катедра по обща хирургия, Медицински център на Университета в Маастрихт, P.O. Box 5800, 6202 AZ Маастрихт, Холандия

С. ван Рейн

1 Катедра по обща хирургия, Медицински център на Университета в Маастрихт, P.O. Box 5800, 6202 AZ Маастрихт, Холандия

2 NUTRIM училище за изследване на храненето и превода в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Ф. Сконяглио

3 Катедра по науки за живота, Университет в Триест, Триест, Италия

L. Stucchi

4 SIGEA Srl, Научен парк AREA, Триест, Италия

М. J. J. Gijbels

5 Катедри по патология и молекулярна генетика, CARIM, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

6 Катедра по медицинска биохимия, Академичен медицински център, Маастрихт, Холандия

Е. Марсич

7 Катедра по медицински, хирургични и здравни науки, Университет в Триест, Триест, Италия

Н. Д. Буви

1 Катедра по обща хирургия, Медицински център на Университета в Маастрихт, P.O. Box 5800, 6202 AZ Маастрихт, Холандия

2 NUTRIM училище за изследване на храненето и превода в метаболизма, Университет в Маастрихт, Маастрихт, Холандия

Свързани данни

Резюме

Въведение

Въпреки обширните изследвания, анастомотичното изтичане (AL) остава едно от най-страшните усложнения след колоректална хирургия. Тъй като е известно, че бутиратните клизми подобряват анастомотичното заздравяване, в това проучване са проучени няколко начина на приложение.

Методи

Изследвани са три интралуминални подхода, включващи бутират: (1) пластир, изясняващ бутирин, (2) еднократна инжекция на хиалуронан-бутират (HA-But) преди изграждането на проксималната анастомоза и (3) ректален хиалуронан-бутират (HA-But ) клизми, предназначени за дистални анастомози. Основният резултат е AL, а вторичните резултати са спукване на налягане, хистологичен анализ на анастомозата, зимография за откриване на активността на MMP и qPCR за генна експресия на MMP2, MMP9, MUC2 и TFF3.

Резултати

Нито пластирите, нито инжекциите доведоха до намаляване на AL в експерименти 1 и 2. В експеримент 3 се постигна значително намаляване на AL с клизмата (HA-But) в сравнение с контролната група заедно с по-високо налягане на спукване. Хистологичният анализ открива само повишено възпаление в експеримент 2 в групата за инжектиране на хиалуронан в сравнение с контролната група. Не са открити други разлики по отношение на зарастването на рани. Зимографията идентифицира намален проензим на MMP9, когато HA-But се прилага като ректална клизма. qPCR не показва значителни разлики между групите в нито един експеримент.

Заключение

Бутиратните клизми са ефективни за засилване на анастомозата на дебелото черво. Подобрените подходи, базирани на бутират, предназначени да намалят AL в животински модели както за проксимални, така и за дистални анастомози, не са по-ефективни, отколкото само бутиратните клизми. По-нататъшните изследвания трябва да се фокусират върху това как екзогенният бутират може да подобри анастомотичното излекуване след стомашно-чревна операция.

Електронен допълнителен материал

Онлайн версията на тази статия (doi: 10.1007/s00384-016-2718-z) съдържа допълнителен материал, който е достъпен за оторизирани потребители.

Въведение

Въпреки обширните изследвания, анастомотичното изтичане (AL) остава едно от най-страшните усложнения след колоректална хирургия. Все още води до висока заболеваемост и смъртност и причинява продължителен престой в болница и високи разходи за здравеопазване [1–3]. Извършени са много проучвания по този въпрос, всички насочени към подобряване на анастомотичното излекуване и по този начин предотвратяване на изтичане. Тъй като честотата на изтичане на анастомоти не е намалявала през годините, необходимостта от решение продължава да съществува [4, 5].

Предишни проучвания при животни показват, че ректалното приложение на бутират - една от преобладаващите късоверижни мастни киселини (SCFA) - води до по-високо налягане на разрушаване в дебелото черво анастомози, като по този начин се претендира за повишена якост, която може да предотврати изтичането на анастомоза [6–8].

Тези положителни резултати не променят настоящата практика, нито са докладвани проучвания при хора, при които пациентите са получавали следоперативни бутиратни клизми за повишаване на анастомотичната сила. Това не е изненадващо, когато смятате, че клиницистите не се интересуват от клизми директно след операцията, особено когато става въпрос за крехка ректална анастомоза. Водоразтворимите контрастни клизми често се използват за определяне на наличието на колоректална AL, най-вече след резекция на ректума. Тези клизми обаче никога не се прилагат в много ранната следоперативна фаза (

Скорошно проучване обаче показа, че бутиратът има забележителни противовъзпалителни и регенеративни ефекти, подобрявайки възстановяването на чревната лигавица при плъхове с колит [9]. Бутиратът стимулира реепителизацията и може да повлияе на лизиса на колаген чрез намаляване на освобождаването на матрична металопротеиназа (ММР) [10]. Бутиратът е продукт на ферментационния процес от бактерии, който се среща главно в дисталното дебело черво. Тъй като той служи като най-важният енергиен източник за колоноцитите [11], нашата хипотеза е, че увеличаването на концентрацията на бутират ще доведе до засилено анастомотично изцеление в дебелото черво. Редица проучвания показват, че бутиратът влияе върху състава и дебелината на слузния слой на дебелото черво чрез промяна на експресията на муцинов ген [12] и хранителен дефицит на епитела на дебелото черво и че бутиратът също може да действа като сигнална молекула чрез специфичен G-протеин, свързан рецептори, които участват в имунното наблюдение на лигавицата на дебелото черво към микробна активност [13]. Съвсем наскоро беше показано, че мишки с недостатъчен слой слуз върху лигавицата на дебелото черво (Muc2 -/-) страдат по-често от анастомотично изтичане в сравнение с контролните мишки [14].

Освен това, проучвания върху животни показват, че бутиратните клизми имат значителен положителен ефект върху левите дебелочревни анастомози, но този ефект е по-слаб от дясната страна на дебелото черво [8]. Очевидно не един и същ обем ще достигне до проксималното място на анастомозата в сравнение с дисталната анастомоза, което може да обясни тези находки. Друго обяснение може да бъде, че продуциращите бутират бактерии се намират главно в слузния слой в дисталната част на дебелото черво, че проксималното дебело черво не реагира на по-голямо количество бутират, просто защото проксималните ентероцити не са запознати с наличието на тази енергия наличен източник и не могат да го използват. За да увеличим благоприятния ефект на бутирата, добавихме хиалуронан (HA), гликозаминогликан, за който е известно, че насърчава неоваскуларизацията, засилва процеса на образуване на белези и има благоприятни ефекти върху клетъчната пролиферация в няколко тъкани [15, 16]. Хиалуронан също играе роля в регулирането на възпалителния отговор. Извличането на свободните радикали и антиоксидантните свойства и предполагаемият му инхибиращ ефект върху протеинази като MMPs изглежда са отговорни за това регулиране, стабилизирайки гранулационната тъкан по време на лечебния процес [16].

В това проучване изследвахме няколко начина за подобряване на проксималната анастомотична сила чрез прилагане на бутират близо до тази анастомоза: с помощта на пластир, инжекции и клизми. Нашата цел беше да разработим метод, който да доведе до по-ниска степен на изтичане на анастомоти и по-практични методи, които могат да бъдат приложени в ежедневната клинична практика.

Методи

Животни

Използвани са осемдесет и четири плъха Wistar с телесно тегло 250–300 g. Животните бяха настанени и обгрижвани в Централното съоръжение за животни на университета в Маастрихт. На всички животни е осигурен свободен достъп до храна и вода и са обгрижвани в съответствие с местните стандарти. Следоперативно оценката на благосъстоянието се извършва два пъти дневно, като се използва стандартизиран метод и на животните се дават лекарства за болка в случай на дискомфорт. Експерименталният протокол е в съответствие с холандския Закон за експериментите с животни и е одобрен от Експерименталния комитет по животните към Медицинския център на Университета в Маастрихт. Бяха спазени насоките ARRIVE за докладване на експерименти in vivo [17] (вж. Също допълнителни данни S1).

Уча дизайн

Основната цел на изследването е да се изследва дали анастомотичното изтичане може да бъде намалено в модел на изтичане чрез прилагане или на интралумален пластир, елуиращ бутирин, еднократно интралуминално приложение на бутират или ежедневна HA-But клизма. За проксималните анастомози използвахме както интралумален пластир, елуиращ бутирин, който покрива анастомозата, така и еднократно интралуминално приложение на хиалуронан-бутират (HA-But). Тъй като повечето изследвания се извършват в дисталната част на дебелото черво, ние също използвахме модел на анастомоза за ляво дебело черво, за да тестваме клизмите HA-But. Това доведе до следните три експеримента:

Пластири, отделящи бутирин (20 маса% трибутирин) спрямо плацебо пластири (n = 12/група)

HA-But инжекция (5% HA, 60 mM бутират) срещу HA инжекция (5% HA) срещу физиологичен разтвор (0.9% NaCl) (n = 8/група)

Пет милилитра HA-But клизма (5% HA, 60 mM бутират) срещу 5 ml натриев бутират (60 mM) клизма спрямо контролна група, която не е получила клизми (n = 12/група)

Пластирите бяха любезно предоставени от Polyganics (Гронинген, Холандия), а клизмите и инжекциите бяха произведени от Sigea (Триест, Италия).

Във всички експерименти проследяването беше 7 дни.

Хирургична процедура

Всички плъхове получават 0,05 mg/kg бупренорфин като аналгетик и са анестезирани с изофлуран. За да се получи достъп до коремната кухина, във всички експерименти е направен 5-сантиметров краниокаудален разрез на средната линия на кожата и коремната мускулатура. След това цекумът беше идентифициран и преместен извън перитонеалната кухина и върху стерилни марли, които бяха хидратирани със стерилен физиологичен разтвор, за да се предотврати дехидратация. За проксимални анастомози дебелото черво се трансектира на два сантиметра дистално от цекума и се създава анастомоза от край до край, използвайки четири прекъснати полипропиленови шева 6/0 (Prolene, Ethicon, Johnson & Johnson) (Exp 1 & 2, виж допълнителните данни S1 ). В експеримент 3 анастомозата се извършва по подобен начин, но при 4 cm ab ani. След извършване на анастомозата червата бяха репозиционирани и коремът беше затворен на два слоя, течащ шев за мускулния слой (Vicryl 4-0, Ethicon, Inc) и прекъснати конци за кожата (Monocryl 4-0, Ethicon, Inc ).

Макроскопични крайни точки

Анастомотичното изтичане беше определено като (1) липса на анастомотично изтичане, (2) малък абсцес на мястото на анастомоза 3, (3) голям (> 1 см 3) абсцес на мястото на анастомоза или (4) пълна дехисценция с перитонит/смърт поради фекалия перитонит. Адхезиите към мястото на анастомоза се оценяват съгласно van der Ham et al. [18]

Напукващо налягане

Нарушаващото налягане се измерва, както е описано по-рано [19]. Накратко, 5-сантиметров сегмент на червата, включващ анастомозата с прилепнали органи, е резециран en bloc и дисталната част на анастомозата е затегната. В проксималния край се поставя пластмасова тръба и се лигира с единичен шев от полиглактин 4/0 (Vicryl, Ethicon). Пълната анастомоза се потапя във фосфатно буфериран физиологичен разтвор, докато въздухът се влива с помощта на манометър (IDEE, Университет в Маастрихт, Холандия) и налягането се увеличава ръчно чрез надуване на дебелото черво. Разрушаващото налягане се определя като вътрешното осветление, при което първоначално се наблюдава изтичане на въздух от анастомозата (mBar).

Подготовка на тъканите

При анестезирани плъхове мястото на анастомоза се дисектира (след измерване на пукнещото налягане) с 0,5-сантиметров марж на всяко място на анастомозата. Пробите от тъкани бяха разделени на три равни части: една за qPCR, една за целите на зимографията и една за целите на имунохистохимията. Последният беше нарязан в надлъжна посока и тъканта беше опъната и закрепена върху корков слой, за да се осигури права анастомотична линия и да се подобри качеството на хистологичната оценка преди фиксирането във формалин (допълнителни данни S2). Секциите бяха депарафинизирани в ксилол и рехидратирани в градуиран етанол до дестилирана вода преди извършване на хистологично оцветяване. Частта, предназначена за анализ на qPCR, беше бързо замразена в течен азот и съхранена при -80 ° C, докато се изисква изолиране на иРНК.

Хистология и имунохистохимия

Срезите бяха оцветени със стандартен хематоксилин-еозин и Picro Sirius Red, използвайки Direct Red 80 и разтвор на пикринова киселина (и двете Sigma-Aldrich, Холандия).

Независим, опитен животински патолог извърши сляпа хистологична оценка на получената тъкан, като оцени (от 0 до 4) хистологични секции за възпаление, приток на гранулоцити, активност на фибробластите и отлагане на колаген. Дажбата на колаген се изчислява с помощта на вътрешна софтуерна програма върху снимки, получени с поляризиран светлинен микроскоп (Leica DM5000B, Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).

Анализ на активността на MMP2, pro-MMP9 и MMP9 с помощта на зимография

Активността на MMP2 и MMP9 се оценява с помощта на желатинова зимография, тъй като увеличаването на активността на MMP е свързано с патогенезата на AL [20]. Пробите се лизират от тъкани и се зареждат върху полиакриламиден гел, съдържащ желатин (10% готов Zymogram гел, Bio-Rad, Холандия). Гелната електрофореза се провежда при 100 V за 30 минути. След това гелът се инкубира с 2,5% Triton X-100 в MQ за 30 минути при стайна температура. След това гелът се поставя в развиващ се буфер при 37 °С за една нощ. Оцветяването на гела се извършва на следващата вечер с PAGE-Blue протеинов разтвор за оцветяване (Thermo Scientific, Холандия). На ден 3 оцветяването беше обезцветено с MQ, разкривайки активността на MMP2 и MMP9. Геловете бяха сканирани с помощта на Bio-Rad GS-800 Денситометър и цифровото количествено определяне беше използвано със софтуер ImageJ (ImageJ Software, Американски национален институт по здравеопазване, Bethesda, Мериленд, САЩ).

Анализ на експресията на MMP2, MMP9, TFF3 и Muc2, използвайки qPCR

маса 1

Последователности на грундове, използвани за експерименти с qPCR

r-MMP9-F1AGCCGACGTCACTGTAACTG
r-MMP9-R1AACAGGCTGTACCCTTGGTC
r-MMP2-F1ACAACAGCTGTACCACCGAG
r-MMP2-R1GGACATAGCAGTCTCTGGGC
R-MUC-F1CGAAGTGAAGAGTGAGCACG
R-MUC-R1GATCCGGGTGGTATTCAGCA
R-Tff-F1GGCCTATCTCCAAGCCAATGT
R-Tff-R1TGCAGAGGTTTGAAGCACCA
GAPDH FWGGAAGCTCACTGGCATGGC
GAPDH RVCCTGCTTCACCACCTTCTTG
Бета-актин FWGACAGGATGCAGAAGGAGATTACTG
Бета-актин RVCCACCGATCCACACAGAGTACTT

статистически анализи

Статистическият анализ беше извършен с помощта на Prism 5.0 за Mac (софтуер Graphpad, Сан Диего, Калифорния). Нормалността беше тествана с помощта на Kolmogorov-Smirnov. Всички непрекъснати променливи са представени като средна стойност и стандартна грешка на средната стойност (SEM) и се сравняват с помощта на студентски t тест или Mann Whitney U, когато е подходящо. Дихотомичните променливи бяха сравнени с помощта на хи-квадрат теста.

Резултати

Макроскопични резултати

В експеримент 1 два плъха от групата с бутиринов пластир умряха преди завършване на проследяването поради фекален перитонит. Всички животни в експеримент 2 завършиха 7-дневното проследяване. В експеримент 3 трима плъхове (един в групата на HA-But, трима в групата But) бяха евтаназирани, тъй като бяха достигнали хуманни крайни точки, поради фекален перитонит. Преглед на видовете анастомотични изтичания във всяка експериментална група може да се намери на фиг. Фиг. 1а. 1 а. При всички експерименти се наблюдават сраствания и няма значителни разлики между експериментите (проксимални спрямо дистални анастомози), нито в рамките на всеки експеримент (фиг. (Фиг. 1б). 1 б). Стана очевидно, че животните, получаващи пластир (или бутирин, елуиращ се, или плацебо), имат по-ниски резултати за хуманно отношение и значително по-голяма загуба на тегло в сравнение с животни, получаващи клизми (Фиг. (Фиг. 1В), 1 С), вероятно поради разширена проксимална част на червата до местоположението на пластира при жертвоприношение.

различни

Обогатените с бутират клизми намаляват AL в Exp. 3, никоя друга интервенция, основана на бутират, не е причинила намаляване на нивата на AL (а). Резултатите от адхезията не се различават значително между групите в опит. 1, 2 или 3 (б). Загубата на тегло е най-видна при опит. 1, когато поставянето на пластирите е причинило внезапна промяна в калибъра на дебелото черво; животните, получаващи клизми, са имали най-нисък процент на загуба на тегло, но също са получавали различен тип анастомоза в сравнение с животните в опит. 1 и 2 (съответно дистално спрямо проксимално) (° С). Прилагането на бутиратни клизми е причинило значително по-високо налягане на спукване на анастомозата в Exp. 3 в сравнение с контролната група. Не са открити разлики в Exp. 2 и в Exp. 1; не се измерва АН поради порести, разширени черва