Резюме

Въведение

Затлъстяването включва необичайно натрупване на телесни мазнини. В резултат на продължителен положителен енергиен баланс, адипоцитите в бялата мастна тъкан (WAT) натрупват липидни капчици, които имат системни последици. Придружаващите дислипидемия, инсулинова резистентност и други системни метаболитни промени са важни дългосрочни последици от затлъстяването (1, 2). Епидемиологията разкрива, че затлъстяването, като компонент на метаболитния синдром, е свързано с ускорена прогресия на няколко вида рак (3, 4). Състоянието на хронично възпаление, протичащо както при рак (5), така и при затлъстяване (1), може да играе ключова роля при свързването на затлъстяването и рака (2). Предполага се също така, че WAT има пряк ефект върху растежа на тумора (6, 7); липсват обаче убедителни доказателства (8, 9). WAT е мощен ендокринен орган, секретиращ адипокини, като цитокини и растежни фактори (1, 10). Лептинът, инсулиноподобните растежни фактори (IGF) и стероидните хормони са изследвани като адипокини, потенциално замесени в рака (8-11). Например, IGF-1, системните нива на които са повишени при затлъстяване, е достатъчен, за да ускори растежа на тумора при ракови модели (12).

клетки

Към днешна дата ролята на WAT в прогресията на рака не е доказана. Проучванията, които показват, че растежът на туморите се ускорява от затлъстяването, предизвикано от диета (DIO), не са отделили успешно ефектите на диетата от ефектите на WAT (11, 31). Тук показваме, че излишъкът от WAT насърчава растежа на тумора, независимо от диетата при мишки. За да изследваме миграцията на клетките от WAT по време на прогресията на рака, използвахме конкурентна репопулация, която не разчита на инвазивни клетъчни инжекции. Ние показваме, че набирането на ендогенни ASC при затлъстяване е свързано с повишена васкуларизация и адипогенеза, придружени от пролиферация на злокачествени клетки.

Материали и методи

Експерименти с животни

Проведени са проучвания на мишки в рамките на Комитета за хуманно отношение към животните към Тексаския университет (Хюстън, Тексас). Миши щамове C57BL/6, C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J (наричани GFP мишки), B6.Cg-Tg (ACTB-mRFP1) 1F1Hadj/J (наричани RFP мишки) и B6.129S7-Rag1tm1Mom/J (наричани RAG-1 мишки) са от Джаксън. За индукция на DIO (32) бяха използвани диети с високо съдържание на мазнини (HFD) D12492 (60 kcal% мазнини) и LFD (LFD) с ниско съдържание на мазнини D12450B (10 kcal% мазнини) от Research Diets. Съставът на тялото е измерен с EchoMRI-100T (Echo Medical Systems), както е описано (33). За присаждане на тумор, 10 6 клетки се инжектират с 21-габаритна игла върху горната част на гърба (LLC и ID8) или в мастната подложка на млечната жлеза (E0771 и MDA-231). Размерът на тумора се измерва с дебеломер; обемът се изчислява като дължина × ширина 2 × 0,52. Тъканите бяха възстановени от мишки, анестезирани с Avertin. Клетките бяха изолирани от тъкани, както е описано (7, 14).

Клетъчни линии и първична клетъчна култура

E0771 (от F.M. Sirotnak), ID8 (от F.C. Marini) и други линии за рак (от American Type Culture Collection) бяха култивирани в модифицирана среда на Dulbecco's Eagle's, съдържаща 10% FBS и удостоверени чрез присаждане на животни и последваща хистология на тумора. Кръвта се възстановява чрез сърдечна перфузия с 10 ml PBS/EDTA и се изолират мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC), както е описано (7, 30). Суспензиите на тъканите се приготвят, както е описано (7, 14). Индукцията на адипогенеза и оцветяването с маслено червено О се провежда, както е описано (14).

Проточна цитометрия

За активирано от флуоресценция клетъчно сортиране (FACS), клетките бяха предварително подготвени, за да се изключат отломки, клетъчни натрупвания, замърсяващи полиморфонуклеарни клетки, червени кръвни клетки, както и мъртви клетки на базата на 7-аминоактиномицин D (7-AAD) оцветяване. Суспензии на тъканни клетки, WAT стромална/съдова фракция (SVF) с отстранени адипоцити (14) или PBMCs бяха сортирани в популации със софтуер FACSAria/FACSDiva (BD Biosciences), базиран на флуоресценция на червен флуоресцентен протеин (RFP) (Тексас Червен канал), GFP флуоресценция [флуоресцеин изотиоцианат (FITC) канал] и следните IgG клонинги: APC-anti-CD34 (RAM34), PE-Cy7-anti-CD31 или PE-anti-CD31 (MEC 13.3), APC-Cy7-CD45 (30 -F11) и съответните контроли за изотип (BD Biosciences). Изотипите и позициите на по-рано характеризираните хемопоетични и ендотелни популации на участъците (7, 14) бяха използвани за определяне на граничните стойности на портата.

Анализ на тъканите

Фиксираните с формалин, вградени в парафин тъкани бяха разделени и анализирани чрез имунофлуоресценция, както е описано (14). Използвани първични антитела са кози анти-GFP (GeneTex, 1: 100); заешки анти-RFP (Abcam, 1: 100); заешки анти-Ki-67 (Thermo Scientific, 1: 100); козе или заешко анти-CD31 (Санта Круз биотехнология, 1: 100); заешки антидесмин (Abcam, 1: 200); и заешки антиперилипин (клетъчна сигнална технология, 1: 100). Вторично магарето Alexa 488 - конюгиран (1: 150) IgG е от Invitrogen и Cy3-конюгиран (1: 300) IgG е от Jackson ImmunoResearch. Ядрата бяха оцветени с Hoechst 33258 или TO-PRO-3 (Invitrogen). Изображенията са получени с конфокален микроскоп Leica TCS SP5/софтуер LAS AF или обърнат флуоресцентен микроскоп Olympus IX70/софтуер MagnaFire. За количествени оценки най-малко 10 произволни × 100 полета за увеличение бяха сляпо отбелязани и/или измерени с помощта на микроскопска решетка.

Статистическият анализ беше проведен с помощта на еднополовия хомосцедастичен тест на Student.

Резултати

Независим от диетата ефект на затлъстяването върху растежа на тумора

Мобилизация на клетки и свързана със затлъстяването инфилтрация на тумори

За да проверим дали ASCs преминават от WAT през системното кръвообращение, проведохме сравнителен анализ на PBMC от слаби и затлъстели мишки, носещи тумори. Анализът на PBMCs (допълнителна фигура S3A и S3B) показа, че докато циркулират CD34 + CD45 - клетките са редки при слаби животни (0,06%), честотата им се увеличава 6 пъти (до 0,37%) при затлъстяване (фиг. 1F). По-голямата част от тези клетки са имали CD34 + CD31 - CD45 - ASC фенотип: ендотелният маркер CD31 се експресира само от 5.9% от CD34 + CD45 - клетките при затлъстели мишки (допълнителна фигура S3A). Анализът на отделни CD34 + CD31 - CD45 - клетки, изолирани от FACS, показва морфология, неразличима от тази на ASC, сортирани паралелно от WAT (Фиг. 1G). Получени от кръвта CD34 + CD31 - CD45 - клетки образуват колонии и натрупани липидни капчици при адипогенна индукция (фиг. 1Н). Свързаното със затлъстяването излизане на CD34 + CD31 - CD45 - адипоцитни предшественици категорично предполага тяхната ASC идентичност. За да получим доказателства, че ASC могат да бъдат наети от тумори, ние подложихме суспензия на туморни клетки на поточен цитометричен анализ. Всъщност туморите съдържат CD34 + CD31 - CD45 - клетки (допълнителна фигура S2) и увеличаването на тяхната честота, свързано със затлъстяването, съответства на възможния им произход от WAT.

Модел за трансплантация на костен мозък за проследяване на клетки, получени от WAT

За да се даде възможност за проследяване на хематопоетична туморна строма (17, 18, 35, 36) успоредно с ASC, ние разработихме in vivo конкурентно изследване за репопулация. Този модел на затлъстяване/рак се основава на 2 сингенни щама на мишката: гостоприемник, повсеместно експресиращ GFP и донор, експресиращ RFP. При химерни GFP/RFP мишки, генерирани чрез трансплантация на костен мозък (Фиг. 2А), е възможно да се разграничат хематопоетичните (RFP +) от гостоприемните (GFP +) клетки. Ние разсъждавахме, че ако ASC трафикът при рак се предполага, затлъстяването трябва да бъде свързано с повишена честота на GFP + клетки в тумори. При индукция на DIO и трансплантация на костен мозък RFP, последвано от едномесечно възстановяване на LFD и HFD, химерите на GFP/RFP са подложени на нормализиране на диетата и след това ортотопно присадени в подложката на млечната жлеза с клетки E0771, линия, получена от аденокарцином на гърдата.

Паралелно проследяване на WAT и медуларни клетки. А, схема за трансплантация. Костният мозък от RFP (червени) мишки се трансплантира в смъртоносно облъчени слаби или затлъстели (DIO) GFP мишки, които се присаждат с тумори след нормализиране на диетата. При затлъстели мишки се увеличава трафикът на GFP + ASC (зелен) от WAT (жълт). B, GFP (зелено) и RFP (червено) флуоресценция на тъкани и клетки (1 ден след посадката), изолирани от затлъстела химера на GFP/RFP. Посочени са левкоцити (стрелки) от гостоприемник (зелен) и донорен (червен) произход и гостоприемници ASC (върхове на стрелки). C, поточно цитометрично изброяване на циркулиращи GFP + (FITC канал) клетки сред жизнеспособни PBMC от представителни слаби и затлъстели E0771 присадени туморни мишки (вляво) и затваряне на GFP + клетки от PBMC на затлъстела мишка, за да изброят CD34 + ASCs като процент на GFP + клетки (вдясно). SSC-A, странично разсейване. D, общо GFP + клетки от PBMCs на слаба и затлъстела мишка (С) се посяват в култура за 1 ден. Посочени са GFP-флуоресцентни (зелени) прилепнали моноцити (стрелки) и клетки с ASC морфология (върхове на стрелки). E, голямо увеличение на GFP + клетки, получени от PBMC със затлъстяла мишка 4 дни след посяването. F, образуване на липидни капчици (*) в колония, образувана от ASCs, получени от затлъстели PBMC на GFP + клетки 7 дни след индуциране на адипогенеза. Мащабна лента, 50 μm.

Както се очаква, RFP + и GFP + клетки се наблюдават във всички миши тъкани (допълнителна фигура S4A и S4B). RFP + клетките бяха потвърдени като CD45 + левкоцити и по-малко от 0,5% от клетките на костния мозък бяха GFP + (допълнителна фигура S4A). Срезовете на бедрената кост разкриха хематопоетични RFP + клетки спрямо GFP + съдови, костни, мускулни и WAT клетки (фиг. 2В). Микроскопският анализ на прилепнали WAT-получени клетки показа типичната ASC морфология на GFP + клетките и RFP флуоресценцията на прилепналите левкоцити (фиг. 2В). За разлика от това, в периферната кръв само редки прилепнали GFP + клетки се наблюдават сред RFP + левкоцитите (фиг. 2В). По-голямата част от малки прилепнали фибробластоидни RFP + моноцити, също наблюдавани при безцветни мишки (фиг. 1D), са макрофаги, както е видно от оцветяването с мастило в Индия и експресията на F4/80 (допълнителна фигура S3B).

В съответствие с данните при безцветни мишки (Фиг. 1F), наблюдаваме честотата на циркулиращите GFP + клетки да е по-висока при затлъстели мишки (1,2%), отколкото при слаби мишки (0,3%) чрез поточна цитометрия (Фиг. 2С). При PBMCs на затлъстели мишки, 0,3% от GFP + клетките имат ASC CD34 + CD31 - CD45 - имунофенотип, докато по-голямата част са CD45 + левкоцити (фиг. 2С). Анализът на прилепналите клетки потвърди, че докато при слаби мишки практически всички циркулиращи GFP + клетки имат моноцитен вид, по-големи GFP + фибробласти присъстват в PBMC на затлъстели мишки (фиг. 2D). Типичният им външен вид на ASC е изявен след 4 дни в култура (фиг. 2Е). Колаген-I, алфа-гладкомускулен актин (α-SMA) и декорин, протеини, експресирани от ASC (7, 14, 23) се експресират в колонии от GFP + CD34 + CD31 - CD45 - клетки (допълнителна фигура S5). Натрупването на липидни капчици при индуциране на адипогенеза на разширените GFP + CD34 + CD31 - CD45 - клетки като адипоцитни родоначалници (фиг. 2F) ги потвърди като ASCs.

Присаждане на хемопоетични и WAT-получени клетки в тумори

Туморна васкуларизация и клетъчна пролиферация, свързани с набиране на ASC

Трихромовото оцветяване на Masson разкрива съпоставимо отлагане на колаген в тумори от слаби и затлъстели животни (допълнителна фигура S7A). Този анализ също така разкрива по-малко обширни области на кръвоизлив и некроза при затлъстели мишки. Имунофлуоресцентният анализ разкрива сравними отлагания на фибронектин, обикновено лишени от GFP + клетки в тумори за всяка група (допълнителна фигура S7B). Тези данни показват, че десмопластичната реорганизация на вътрешния туморен матрикс не се влияе значително от затлъстяването в използваните модели.

Кръвоносните съдове са от съществено значение за доставянето на кислород и хранителни вещества, а съдовата проходимост предопределя растежа на тумора (35, 37). Поради това изследвахме дали вербуването на ASC е свързано със съдово ремоделиране. При затлъстели мишки по-висок дял от ендотелните клетки са от гостоприемника, както се разкрива чрез луминална ко-локализация на CD31 с GFP (фиг. 4А и В). При слаби мишки кръвоносните съдове са редки в определени туморни области, докато при затлъстелите мишки те са в изобилие в цялата туморна маса (фиг. 4А). Количественото определяне разкрива 2 пъти по-висока съдова плътност при тумори от затлъстели мишки (фиг. 4С). Туморните съдове при слаби мишки бяха компресирани и тънки, докато при затлъстелите мишки те бяха по-хипердилатирани (фиг. 4С) и пълни с циркулиращи кръвни клетки (фиг. 4А и Б). Изброяването на съдове, положителни за desmin + GFP + клетки (фиг. 4D), показва тенденция за повишено съзряване на съдовете при тумори от затлъстели мишки (фиг. 4С). В допълнение, експресията на α-SMA, периваскуларен маркер, експресиран върху ASC (7, 14, 23), е по-обилна при периваскуларни GFP + клетки при затлъстели мишки (Фиг. 4Е). Комбинирани, тези резултати подсилват схващането, че ASCs допринасят за натрупването на периваскуларни клетки в туморите по начин, зависим от затлъстяването.

Наблюдение, последователно направено за тумори, отглеждани при затлъстели животни, е, че туморните капсули са значително по-дебели, отколкото при слаби мишки (Фигури 3В и 5А и В). Съставът на туморните капсули също изглежда различен при затлъстели животни (допълнителна фигура S8A). Визуално очевидно повишено затлъстяване беше потвърдено чрез имунофлуоресценция, идентифицираща перилипин, маркер на зрели липидни капчици (Фиг. 5А). Многобройни големи GFP + клетки също бяха наблюдавани разпръснати в тумора и съдържаха еднолокулни перилипин-положителни липидни капчици, показващи ги като адипоцити. Докато присъствието на адипоцити в периферията на тумора потенциално би могло да бъде обяснимо чрез нарастване на околната съединителна тъкан, наличието на отделни адипоцити в изобилие в ядрото на тумора показва тяхната диференциация от присаждането на прародители. Интересното е, че средният размер на адипоцитите е значително по-голям при тумори, отглеждани при затлъстели животни (фиг. 3 и 5), въпреки диетата, изключена като променлива.

Дискусия

Нашите резултати показват, че затлъстяването може да ускори растежа на тумора, независимо от едновременната диета. Въпреки че има множество системни ефекти, чрез които затлъстяването може да насърчи рака (34), в това проучване ние се съсредоточихме върху потенциалната роля на излишния WAT. Ние предположихме, че в допълнение към системното секретиране на адипокини, WAT служи като източник на клетки, наети от тумори и стимулиращ рак чрез локално секретирани паракринни фактори. Докато костният мозък е добросъвестният източник на хематопоетични клетки, допринасящ за микросредата на тумора (18, 35, 36), нашите резултати показват, че мезенхимните предшественици се набират за тумори, поне отчасти, от WAT. Доказателства за това явление се появиха в други скорошни доклади (7, 22–24, 38). Предходните проучвания обаче се основават на данни от инвазивни нефизиологични модели. Тук предоставяме доказателства за трафик на ASC от ендогенен WAT in vivo.

Нашите данни показват, че комбинация от повишена наличност на ASC и сигнализирането им за трафик води до нетно увеличение на набирането на ASC към тумори при затлъстяване. Нашите открития са в съответствие с наблюдаваните по-рано промени в състава на клетъчната туморна микросреда при затлъстяване (9, 39). Наблюдаваното мобилизиране на ASC, свързано със затлъстяването, едновременно с натрупването им в туморна строма/васкулатура, показва, че WAT допринася за пула от мезенхимни туморни клетки. Нашите данни аргументират възможността пролиферацията на инфилтриращи ASC значително да допринесе за увеличеното им изобилие от тумори. Въпреки че е вероятно ASCs да проникнат в тумора от съседните околни WAT чрез миграция през твърди тъкани, последните доклади за мобилизиране на мезенхимни родоначалници при пациенти с рак (29, 40) независимо посочват кръвния поток като допринасящ път. Неотдавнашните ни данни показват, че CXCL1 и интерлевкин (IL) 8, секретирани от туморни клетки и сигнализиране чрез рецептори CXCR1 или CXCR2, са замесени в миграцията на човешки оментални ASC (24) и бъдещи проучвания ще установят основните механизми по-нататък.

Предложен работен модел за трафик на рак на ASC. В допълнение към костния мозък, WAT е източник на клетки, наети от тумори. Докато туморните левкоцити се набират главно от костния мозък, мезенхималната туморна строма, перицитите и адипоцитите могат да бъдат получени от ASC, мигриращи от WAT.

В обобщение, това проучване установява набирането на клетки, получени от WAT, чрез тумори като потенциален принос за стимулиращите ефекти на затлъстяването върху прогресията на рака. Предлагаме няколко различни ASC функции да допринесат за индукция на растежа на тумора, наблюдавана при затлъстяване. Очевидната активност на WAT-получени клетки в тумори повдига въпроса за безопасността на липотрансферните процедури при пациенти с рак (45). Последните проучвания показват ролята на стромата, получена от WAT, в метастазите на рака (22), а разработването на подходи за целенасочено инактивиране на ASC ще даде възможност за идентифициране на техните специфични роли в отделни етапи на прогресия на рака. Ние предлагаме ASC като потенциална терапевтична цел при рак.

Разкриване на потенциален конфликт на интереси

Не са разкрити потенциални конфликти на интереси.

Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Принос на авторите

Концепция и дизайн: M.G. Колонин

Разработване на методология: Y. Zhang, A.C. Daquinag, M.G. Колонин

Придобиване на данни (предоставени животни, придобити и управлявани пациенти, осигурени съоръжения и др.): Y. Zhang, A.C. Daquinag, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Колонин

Анализ и интерпретация на данни (напр. Статистически анализ, биостатистика, изчислителен анализ): Y. Zhang, A.C. Daquinag, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Колонин

Написване, преглед и/или преразглеждане на ръкописа: Y. Zhang, A.C. Daquinag, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Колонин

Административна, техническа или материална подкрепа (т.е. докладване или организиране на данни, изграждане на бази данни): Y. Zhang, F. Amaya-Manzanares, O. Sirin, C. Tseng, M.G. Колонин

Надзор на проучването: Y. Zhang, M.G. Колонин

Безвъзмездна помощ

Работата е подкрепена с грант CNE-119003 от Американското общество за борба с рака, както и безвъзмездни средства RP100400 и RP110776 от Института за превенция и изследване на рака в Тексас (CPRIT).