Резюме

1. Ефект на мутациите върху стабилността и свързването

структурна

Правдоподобен ефект на мутации в мембранни протеини: спирално изкривяване се въвежда поради силиконови мутации на два последователни остатъка (100-Ile, 101-Thr) към глицин (спирален спирач) в KcsA протеин на калиев канал (PDB ID: 1J95).

2. Мутация и нейната компенсация: Структурна пластичност и конформационна релаксация

Ефект от мутации в глобуларни протеини: седем ядра (хидрофобни) остатъци, мутирали до метионин (ляв панел: естествен, десен: мутант) във фаг Т4-лизозим и въпреки това гънката се запазва без почти никакви забележими изкривявания. Това се случва поради „структурна релаксация“ в протеините поради присъщата им конформационна пластичност (адаптивност към промените).

3. Мутации при ВРЛ в сравнение с глобуларните и мембранните протеини

Ефект на мутациите в неподредени протеини. Четири преходни (трептящи) солни моста, образуващи заредени остатъци (1-Asp, 6-His, 16-Lys, 28-Lys), мутирали към аланин в бета амилоид (Aβ42), което води до демонтажа в солеви мостове в световен мащаб в целия структурен ансамбъл ( Ляв панел: мутант в сравнение с десния: естествен). Тези преходни солеви мостове непрекъснато променят своите партньори по цялата симулационна траектория, поддържайки различни конформации в различни моменти от време и по този начин поддържат конформационен ансамбъл (илюстриран на фигура 3 от справка [19]). Жълтите прекъснати линии в левия панел (роден) показват солените мостове, намерени поотделно в петте произволно избрани конформера (в рамките на 4 Å), докато същите връзки са показани от по-тънки цианови пунктирани линии в десния панел, за да изобразят липсата на тези йонни взаимодействия (далеч по-големи от 4 Å). Траектории за симулация на молекулярна динамика, събрани от Справка [19]. Накратко беше проведена симулация на експлицитна молекулярна динамика (MD) с AMBER 12 при T = 300 K, използвайки силовото поле ff99SB с периодични гранични условия и модела на водата TIP3P. Фигура реконструирана в Pymol.

Друг ефективен и важен начин за класифициране на мутациите може да се основава на действителната последица от мутацията дали тя нарушава чисто структурната цялост на протеина [52] или засяга протеиновите функции. Например, проксималните остатъци могат да се развият съвместно в протеинова гънка, за да запазят глобалната стабилност, докато точковите мутации (включително вмъкване-делеции) могат потенциално да прецизират функцията на протеина, модифицирайки функционалните места и протеиновите взаимодействия [53]. Отново функционалните мутации могат да бъдат проксимални или директни към каталитично/активното място [54,55], както и дистални (алостерични и регулаторни). Установено е, че ефектът от дисталните мутации се разпространява по цялата протеинова гънка, засягайки както неговата динамика, така и катализата, при което нискочестотните торсионни трептения [56,57] изглежда играят ключова роля. Мутационни горещи точки [58] са идентифицирани (напр. В човешка моноацилглицерол липаза, човешка ДНК полимераза β) въз основа на такива далекосъобщителни центрове в протеинова конформационна динамика [59,60,61]. Такава информация може потенциално да улесни разработването на нови лиганди с терапевтична стойност [59].

4. Проучване на ролята на мутациите в болестите: Проследяване на промените в термодинамичните параметри

5. Статистическа класификация на мутациите въз основа на тяхната степен на вредност

6. Смекчаване и групиране на ефектите от генетични варианти, причиняващи заболяване във връзка с дизайна на лекарства

В методологията на лекарствения дизайн насочването към специфични болестотворни мутации и изясняване на мутационните ефекти е от голямо значение, особено за подходите, изискващи структурна информация за целевия протеин. Методите за изчисляване на свободната енергия се използват за определяне на доминиращите ефекти на мутациите, независимо дали влияят върху стабилността на протеина, свързването с протеините или и двете. С задълбочения анализ на ефекта от мутациите на молекулярно ниво, болестотворните мутации в прицелните протеини могат допълнително да бъдат групирани от техните основни ефекти като дестабилизираща мутация, каталитични мутации, мутации, засягащи димеризацията или протеиновите конформации [102,103,104 ]. Такива видове класификация могат да помогнат при проектирането на лекарства за определени групи мутации със сходни ефекти и следователно е приложим за по-широк спектър от диагностика и терапия.

7. Структурен подход в проектирането на лекарства

Структурният лекарствен дизайн (SBDD) е изчислителният подход, който разчита на познаване на 3D структури (Фигура 4) на биологичните цели, за да идентифицира или проектира потенциалната химическа структура, подходяща за клинични тестове [100,105]. С експлозията на геномна, функционална и структурна информация през последните десетилетия, повечето биологични цели с 3D структура бяха идентифицирани и стимулираха приложенията на структурно-базирани подходи в настоящия проект. SBDD е популярен за виртуален скрининг за филтриране на подобни на лекарството съединения от голяма библиотека с малки молекули, включително широко прилагани подходи, като например докинг и структурен фармакофорен дизайн [105]. Докато установеният скрининг с висока производителност (HTS) [106] позволява автоматично тестване на широк спектър от съединения (до милиони), ниският процент на успех и високата цена заедно ограничават приложенията му. Като алтернатива могат да се използват изчислителни подходи за намаляване на броя на съединенията, подложени на изпитване [105, 106], където докингът и структурно-базиран фармакофорен дизайн са двата най-популярни подхода, насочени към вредни мутации.

Схематично представяне на процеса на откриване на лекарството за смекчаване на ефектите от болестотворни мутации.

7.1. Докинг

Спасяване на активността на мутант р53 чрез свързване на стиктинова киселина в отворения джоб L1/L3. Представителната схема се генерира, използвайки структурата на p53 ядрен домейн комплекс с ДНК (PDB: 1TSR). Атомите в представяне на сфера принадлежат на стиктинова киселина в дадена докирана поза (хетероатоми, оцветени според стандартната схема за оцветяване на Химера). ДНК основите са представени като сини квадрати.

Освен изследванията на рака, скрининг на базата на докинг се използва и при редки заболявания. Синдромът на Снайдър-Робинсън (SRS) е рядко психично заболяване, свързано с Х, причинено от неправилното функциониране на важен човешки ензим, спермин синтазата [118]. Спермин синтазата функционира като хомо-димер и мутации, влияещи на димеризацията, като G56S, показват, че премахват ензимната активност, за да доведат до заболяването [96,118]. Неотдавнашната работа е насочена към идентифициране на димерни стабилизатори чрез свързване към мутантния интерфейс на хомо-димер [119]. Интегрирани големи търговски съставни библиотеки бяха използвани за този базиран на докинг виртуален скрининг с представителните структури на димера [119]. След това най-добре класираните 51 съединения бяха подложени на експериментален скрининг, от които три най-високо класирани съединения (известни също като „потенциални клиенти“) показват, че повишават каталитичната активност до 30% [119,120].

7.2. Структурен дизайн на фармакофор

Фармакофорните модели могат да се използват за създаване на ансамбъл от абстрактни стерични и електронни характеристики, представляващи макромолекулни (целеви протеини) взаимодействия с подобни на лекарството малки молекули [121,122]. С други думи, триизмерните подреждания на тези характеристики, като хидрофобни центроиди, ароматни пръстени и водородни връзки са представяне на режима на свързване между лигандата и целта [122,123]. Фармакофорите се генерират от общи характеристики на активните лиганди, които се идентифицират чрез подравняване или наслагване на конформерите на комплекси лиганд-мишена или известни активни молекули [123]. Множество дегенерирани атомни модели могат потенциално да бъдат получени от програми за фармакофорно моделиране, изискващи допълнителна оптимизация и валидиране, за да се избере най-добрият. Фармакофорните модели обикновено се използват за виртуален скрининг на активни малки молекули от големи бази данни за съединения [121,122,123]. Такива подходи могат да бъдат по-ефективни от докинг за определени цели, особено когато са налични голям брой съществуващи известни активни съединения [124, 125, 126].

По този начин фармакофорът по същество определя рамката на взаимодействие между активните лиганди и техните специфични цели [121,122] и съответните модели могат също да бъдат изградени само с библиотеки от активни лиганди, при липса на 3D структурата на мишената - подход, известен като фармакофор на базата на лиганд. След това моделите в тях могат да бъдат обучени за дискриминация между активни и неактивни молекули [121]. Всъщност това служи като основна причина за широкото използване на фармакофорните модели във виртуалния скрининг, особено когато липсва целевата структура. В допълнение, тъй като фармакофорният модел представлява свързването (или картата на взаимодействие) на „активното съединение-мишена взаимодействие“, той осигурява правдоподобна връзка между структурата и лигандната активност и би могъл да помогне за изясняване на основния биохимичен механизъм за по-нататъшно насочване на дизайна на новите активни съединения [122]. Например, чрез изследване на различните фармакологични свойства, последните проучвания изглежда подобряват ефикасността на съществуващия фармакофор и проектират нов инхибитор на рецептора на епидермален растежен фактор (EGFR), потенциално инхибиран от първични мутанти (L858R, del9) и резистентни към лекарства мутанти, като напр. L858R/T790M [128].

8. Подходи, основани на лиганди в дизайна на лекарства

При липсата на структурна информация за целевите протеини, гореспоменатите структурно-базирани подходи може да не са подходящи за проектиране на лекарства. Като алтернатива, дизайнът на лекарства, базиран на лиганд (LBDD), може да бъде приложен за подпомагане на такива случаи [131,132,133,134]. Методите, базирани на лиганд, се фокусират само върху анализа на физико-химичните свойства на известни лиганди, които взаимодействат с целта на интересите. Най-популярните подходи обаче са количествените модели структура-активност (QSAR) и моделирането на фармакофор на базата на лиганд [134]. По отношение на лекарствения дизайн, насочен към мутантните протеини, LBDD може да бъде ефективен за нови мутации, чиито ефекти все още не са изследвани.

9. Помагане на лекарствения дизайн чрез познаване на мутациите на глобуларни, мембранни и разстроени протеини

Разбирането на молекулярния механизъм на свързаните с болестта мутации може директно да се приложи към лекарствения дизайн [91, 101]. Структурната биология е допринесла за такова разбиране, допринасяйки ефективно за ранното откриване на лекарства [140] и също така изяснявайки въздействието на свързаните с болестта мутации и лекарствената резистентност при ракови заболявания и инфекциозни заболявания. Информацията относно диференциалните ефекти на мутациите върху глобуларни, мембранни и неподредени протеини може да бъде от полза за избора и прилагането на най-подходящата и ефективна стратегия за проектиране на потенциални лекарствени молекули за всеки отделен случай. По-голямата част от заболяванията са пряко свързани с промените в стабилността на свързване или стабилността на сгъване на мутирали протеини [63] - изследвани чрез свързване или сгъване на свободни енергии. Такава информация също така показва до каква степен мутациите нарушават протеиновите взаимодействия или структурната цялост, предоставяйки важни насоки за проектирането на стабилизатори и/или инхибитори за смекчаване или премахване на вредните ефекти на мутациите.

В допълнение, наличието на 3D структури на целеви протеини е от голямо предимство да се използва при изчисления на свободна енергия, съчетани с MD симулации за задълбочено изследване на основния структурен механизъм (напр. Разрушаване на хидрофобното ядро ​​или загуба на водородна връзка) на мутационните ефекти подвързване или сгъване. Както беше обсъдено в по-ранен раздел, такава информация беше успешно използвана за идентифициране на правилните лекарствени молекули, насочени към мутациите, свързани със синдрома на Снайдер-Робинсън (SRS). SRS се причинява от неправилно функциониране на човешкия ензим, спермин синтаза (глобуларен протеин), при което известните съществуващи вредни мутации засягат функционалността на естествения протеин чрез широк спектър от молекулни механизми, като дедимеризация, дестабилизация на мономера и нарушаване на каталитичното ядро ​​[96,119,120,141].

Мутационната резистентност към лекарства също ограничава живота на много успешни лекарства. Като алтернатива на дизайна на нови лекарствени молекули за преодоляване на такава резистентност са разработени стратегии, като ансамблен протеинов дизайн [142], които се прилагат в началото на процеса на разработване, за да се предвидят и преодолеят ефектите от възможните мутационни резистентност (напр. при дихидрофолат редуктаза на Staphylococcus aureus). Такъв протокол за проектиране има двоен атрибут, а именно, положителен дизайн за поддържане на каталитичната функция и отрицателен дизайн, който да пречи на свързването на оловен инхибитор едновременно.

Промяната в конформацията и динамиката на протеините също са тясно свързани със значителен брой човешки заболявания [143,144,145]. Изчислителните подходи, като симулации на MD или Mote Carlo (MC), са мощни инструменти за изследване на динамиката на протеините. Мутациите могат да променят протеиновата динамика по различни начини, като промяна на местната гъвкавост, преход в конформационни състояния, алостерични регулации и т.н. Проучването на алостеричните регулации може да служи като потенциални алтернативи за случаите, когато естественият джоб за свързване е твърде труден за свързване с малки молекули [91]. Разрешаването на експериментални структури на дестабилизиращи мутанти често се оказва трудно, особено за мембранните протеини поради присъщата им неразтворимост и нестабилност [146,147] и в такива случаи, молекулярното моделиране на мутантни структури може да даде някои насоки относно мутационните ефекти. Такива алтернативни структури често се подлагат на докинг на съставни библиотеки при виртуален скрининг - методология, известна като „ансамблен дизайн на лекарства“ [148,149]. Особено за вътрешно разселените лица, при които има категорична липса на подредени структури, молекулярното моделиране и симулацията на МД се прилагат широко за извличане на представителния структурен ансамбъл в структурен лекарствен дизайн [145, 150].

От друга страна, високопроизводителният скрининг и рационалният лекарствен дизайн значително подпомогнаха взаимодействието на мембранните протеинови взаимодействия, тъй като те са достъпни на клетъчната повърхност и могат директно да променят клетъчната сигнализация [151]. Това всъщност е ключовата причина, поради която по-голямата част от терапевтичните средства са насочени към мембранни протеини. Техники, като сканиране на аланин, също са служили за идентифициране на стабилизиращи мутации в изчислителния дизайн на мембранните протеини, както и при разработването на лекарства [152]. За тази цел са разработени рамки, като RosettaMP, които осигуряват общо представяне на мембраната, което взаимодейства с точкуване, конформационно вземане на проби и мутационни процедури, предлагащи голяма лекота и гъвкавост за интегрирането им в нови дизайнерски протоколи [153]. Пептидната архитектоника [154] е сравнително ново допълнение в субекта, при което идеята е да се изберат под-последователности на естествен пептид, селективно токсичен само за патогенните мембранни протеини. Като алтернатива на дрогирането (тъй като често има липса на структурна информация за трансмембранните протеини), също така се опитва да разработи протеинова терапия [147] за мембранни белтъчни цели, но пълният му потенциал тепърва ще бъде проучен.

10. Заключения

Принос на автора

E.A. замислил проблема. S.B. и Y.P. направи проучване на литературата и написа статията с помощта на E.A. S.B. организира ръкописа и широко го редактира по време на ревизиите. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.

Финансиране

Работата беше подкрепена с грант от NIH, номер на грант 1R01GM125639.