От лабораторията за метаболизъм на липидите и лабораторията за масова спектрометрия, Център за изследване на човешкото хранене на САЩ по въпросите на храненето на Жан Майер в Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс и Централната болница на университета в Хелзинки, Финландия (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

lys107

От лабораторията за метаболизъм на липидите и лабораторията за масова спектрометрия, Център за изследване на човешкото хранене на САЩ по въпросите на храненето на Жан Майер в Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс и Централната болница на университета в Хелзинки, Финландия (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

От лабораторията за метаболизъм на липидите и лабораторията за масова спектрометрия, Център за изследване на човешкото хранене на САЩ по въпросите на храненето на Жан Майер в Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс и Централната болница на университета в Хелзинки, Финландия (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

От лабораторията за метаболизъм на липидите и лабораторията за масова спектрометрия, Център за изследване на човешкото хранене на САЩ по въпросите на храненето на Жан Майер в Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс и Централната болница на университета в Хелзинки, Финландия (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

От лабораторията за метаболизъм на липидите и лабораторията за масова спектрометрия, Център за изследване на човешкото хранене на САЩ по въпросите на храненето на Жан Майер в Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс и Централната болница на университета в Хелзинки, Финландия (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

От лабораторията за метаболизъм на липидите и лабораторията за масова спектрометрия, Център за изследване на човешкото хранене на САЩ по въпросите на храненето на Жан Майер в Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс и Централната болница на университета в Хелзинки, Финландия (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

От лабораторията за метаболизъм на липидите и лабораторията за масова спектрометрия, Център за изследване на човешкото хранене на САЩ по въпросите на храненето на Жан Майер в Университета Туфтс, Бостън, Масачузетс и Централната болница на университета в Хелзинки, Финландия (M.T.-K., R.M., M.-R.T.).

Резюме

Доказано е, че няколко генни мутации на apoA-I са свързани с намаляване на нивата на HDL холестерол и аполипопротеин. 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Някои се дължат на големи делеции и големи пренареждания на ДНК, а други на точкови мутации. 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Наскоро описахме финландски род с 3-bp делеция в гена apoA-I, което доведе до отстраняване на кодона за Lys 107 в зрелия apoA-I [apoA-I (Lys107 → 0)]. Отличителни характеристики на пациентите с апоА-I (Lys107 → 0) са намалените плазмени концентрации на HDL холестерол и Lp (AI w AII), но нормални концентрации на Lp (AI) частици. 19.

Предишни кинетични проучвания разкриват, че RT в плазмата на apoA-I е по-кратък от този на apoA-II. 20 21 22 23 24 25 26 Rader et al 26 съобщават, че скоростта на оборот на апоА-I в Lp (AI) частици е по-бърза от тази на апоА-I в Lp (AI w AII) частици при нормални субекти. Съобщава се, че FCR на apoA-I е основният фактор, контролиращ плазмените нива на apoA-I. 22 25

Целта на нашето проучване беше да се изследва in vivo метаболизмът на apoA-I и apoA-II и в двете HDL частици, Lp (AI) и Lp (AI w AII), при субекти, хетерозиготни за apoA-I (Lys107 → 0) мутация за изясняване на кинетичния механизъм, отчитащ намалените нива на Lp (AI w AII) при тези пациенти.

Методи

Учебни предмети

Най-малко 3 седмици преди метаболитните проучвания, пациентите са получили изокалорична диета с естествена храна, състояща се от 36% мазнини (15% наситени, 15% мононенаситени и 6% полиненаситени), 15% протеини и 49% въглехидрати, с съдържание на холестерол от около 150 mg/1000 kcal. Протоколът за изследване е одобрен от Етичния комитет на Централната болница на университета в Хелзинки и от Комитета за преглед на човешките разследвания към Медицинския център в Нова Англия и Университета Туфтс. Клиничните характеристики и плазмените липидни стойности на всички участници са дадени в таблица 1 .

Протокол за изследване

Изолиране на плазмени липопротеини

Плазмените липопротеинови фракции бяха изолирани чрез последователно ултрацентрифугиране в ултрацентрифуга Beckman L8-70 (Beckman Instruments), използвайки ротор Beckman 50TI, както беше описано по-горе. 28 VLDL, IDL, LDL и HDL бяха изолирани при плътности съответно 1.006, 1.019, 1.063 и 1.21 g/ml.

Разделяне на Lp (AI) и Lp (AI w AII)

Определяне на обогатяването на деутерий

АпоА-I и апоА-II протеиновите ленти се изрязват от полиакриламидните гелове и се хидролизират в 12N HCI при 110 ° за 24 часа и се сушат под азот. Хидролизатите се превръщат в н-пропилов естер и н-производни на хептафлуоробутирамид и изсушени под азот, както е описано по-горе. 31 След повторно разтваряне в етилацетат, бистрият супернатант се поставя във флакони с автосамплер (Kimble). За измерване на обогатяването на деутерий в плазмата, след хидролиза на протеините, свободните аминокиселини бяха изолирани с помощта на Dowex AG-50W-X8 100- до 200-меш катионообменна смола (Bio-Rad) и превърнати в н-пропилов естер и н-производни на хептафлуорбутиамид, както е описано по-горе. Всички проби бяха анализирани с 5985B газов хроматограф – масспектрометър (Hewlett Packard), използвайки отрицателна химическа йонизация и метан като реактивен газ.

Анализи на кинетични данни

Аналитични методи

Нивата на холестерола и триглицеридите в плазмените и липопротеиновите фракции бяха анализирани със стандартизирани ензимни методи. 31 Концентрацията на HDL холестерол се измерва в плазмата с помощта на метода декстран сулфат – Mg 2+ утаяване. 36 Плазмените концентрации на апоА-I и апоВ се изследват с неконкурентен, ензимно-свързан имуносорбентен анализ, като се използват имунопречистени поликлонални антитела. 37 38 Концентрацията на Lp (AI) в HDL субфракцията беше измерена чрез използване на имуноелектрофореза 39 с налични в търговската мрежа комплекти, състоящи се от хидратирани агарозни гелове и моноспецифични антисеруми към apoA-I и apoA-II (Sebia). Концентрациите на apoA-I в Lp (AI) и apoA-II в Lp (AI w AII) се определят, като се използват стандарти, предоставени от производителя. Концентрацията на apoA-I в Lp (AI w AII) частици се изчислява чрез изваждане на концентрацията на Lp (AI) от общата плазмена концентрация на apoA-I, анализирана чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ. Коефициентите на вариация между и в рамките на теста за липидните анализи са 19, средното съотношение на HDL холестерол/(апоА-I + апоА-II) при пациенти (0,19) е значително по-ниско, отколкото при контролните субекти (0,32, P −1 · d −1), отколкото при контролните субекти (2.49 ± 0.85 mg · kg −1 · d −1, P -1 - d -1) и контролни субекти (5.61 ± 1.74 mg · kg -1 - d -1, таблица 5). Средните APR на apoA-II при пациенти (1,58 ± 0,59 mg · kg -1 d-1) и контролни субекти (1,46 ± 0,65 mg · kg -1 -1 d -1) са сходни. Установено е, че съотношението на APR на apoAI към Lp (AI) и Lp (AI w AII) частици (APR съотношение) е най-различителният параметър между пациентите и контролните субекти. Средното съотношение на APR на пациентите (1,29 ± 0,11) е повече от два пъти по-високо от съотношението на APR на контролните субекти (0,46 ± 0,12) (P 40 При пациентите APR на общия apoA-I е по-висок, отколкото при контролните субекти, а този на apoA-II е подобен на контролните субекти. Следователно намалените плазмени концентрации на апоА-I и апоА-II в хетерозиготите на апоА-I (Lys107 → 0) не са последици от дефекти в производството на апоА-I или апоА-II, а се дължат на засилен фракционен катаболизъм.

Връзката между ниските плазмени нива на HDL холестерол и in vivo метаболизма на apoA-I и apoA-II е интензивно проучена. Ginsberg и сътр. 55 установяват по-висок FCA на apoA-I, но сходни нива на производство на apoA-I при пациенти с изолиран нисък HDL холестерол или нисък HDL холестерол, свързани с повишена плазмена концентрация на триглицериди в сравнение с нормолипидемични пациенти. По подобен начин, Gylling et al 56 съобщават за нормална скорост на производство на апоА-I и намалена плазмена RT на апоА-I за нормолипидемични пациенти с намалени нива на HDL холестерол. Brinton et al 57 демонстрират обратна корелация между нивото на HDL холестерол в плазмата и FCR както на апоА-I, така и на апоА-II. Taskinen et al 58 и Brinton et al 25 показват, че плазмената концентрация на Lp (AI w AII) частици зависи главно от скоростта на синтез на тези частици. Противно на предишните наблюдения, синтезът на Lp (AI) се увеличава и синтезът на Lp (AI w AII) е нормален при пациенти с апоА-I (Lys107 → 0).

In vivo метаболизмът на apoA-I е изследван в две мутантни форми на apoA-I чрез използване на радиойодиран апоА-I. Един от тези варианти на apoA-I, apoA-IMilano, е първата описана вариантна форма на аполипопротеин A-I, при която цистеинът е заместен с аргинин в аминокиселина 173 на зрелия апоА-I протеин. 10 ApoA-IMilano субекти се характеризират с намалени нива на HDL холестерол и apoA-I. Другият вариант на apoA-I, apoA-IIowa, е вариант, при който заместването на глицин с аргинин в остатък 26 на apoA-I е свързано с хипоалфалипопротеинемия и системна амилоидоза. 11 При пациенти с apoA-IMilano намалената концентрация на apoA-I е демонстрирана от Roma et al 59, че е следствие от повишен катаболизъм както на анормален apoA-I, така и на нормален apoA-I, докато общата скорост на производство на апоА-I е нормална. При пациенти с апоА-IIowa, Rader et al 60 съобщават за повишен процент на клирънс на радиоактивно маркиран апоА-IIowa в сравнение с контролните субекти. Скоростта на производство на аполипопротеин A-I при пациентите с апоА-IIowa е нормална. Метаболизмът на апоА-II не е изследван нито при апоА-ИМилано, нито при апоА-ІІова.

Описани са над 20 различни апоА-I варианта, причинени от точкови мутации, делеции или пренареждания на апоА-I гена. Някои от тези варианти на апоА-I очевидно са свързани с намалени плазмени концентрации на HDL холестерол и аполипопротеин А-I. Резултатите от това проучване показват, че повишената скорост на клирънс, а не намалена скорост на производство на апоА-I и апоА-II, отчита значително по-ниските нива на Lp (AI w AII) частици и HDL холестерол при пациенти с апоА- I (Lys107 → 0) вариант. При пациентите по-висок дял от новосинтезиран апоА-I навлиза в плазмата в рамките на Lp (AI), отколкото в Lp (AI w AII), което може да обясни нормалните нива на Lp (AI).