Концептуализация на ролите, официален анализ, придобиване на финансиране, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

суровото

Настоящ адрес: Департамент по лозарство и енология, Институт по биотехнология на виното, Университет Стеленбош, Матиленд, Южна Африка

Отдел за асоциации по биоразнообразие и молекулярна екология, Център за изследвания и иновации, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия, Департамент по ветеринарна медицина, Университет на Милано, Милано, Италия

Писане на роли - преглед и редактиране

Отдел за асоциации по биоразнообразие и молекулярна екология, Център за изследвания и иновации, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия, Департамент по биология, Университет във Флоренция, Sesto Fiorentino, Firenze, Италия

Роли Куриране на данни, формален анализ, софтуер, визуализация, писане - преглед и редактиране

Партньорски отдел по изчислителна биология, изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия

Роли Формален анализ, писане - преглед и редактиране

Отделение за биоразнообразие и молекулярна екология, Център за изследвания и иновации, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия

Методология на ролите, писане - преглед и редактиране

Център за трансфер на технологии за свързване, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия

Роли Формален анализ, писане - преглед и редактиране

Отделение за биоразнообразие и молекулярна екология, Център за изследвания и иновации, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия

Роли Формален анализ, Методология

Отделение за биоразнообразие и молекулярна екология, Център за изследвания и иновации, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия

Партньорски отдел по геномика и биология на овощните култури, Център за изследвания и иновации, Fondazione Edmund Mach, S. Michele all ’Adige (TN), Тренто, Италия

Роли Формален анализ, софтуер, писане - преглед и редактиране

Партньорски отдел по изчислителна биология, изследователски и иновационен център, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия

Придобиване на финансиране на роли, разследване, писане - оригинален проект

Отделение за биомедицински, хирургични и дентални науки, Университет дели Студи ди Милано, Милано, Италия

Придобиване на финансиране на роли, надзор, писане - оригинален проект

Отделение за ветеринарна медицина, Университет на Милано, Милано, Италия

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение за биоразнообразие и молекулярна екология, Център за изследвания и иновации, Fondazione Edmund Mach, San Michele all’Adige, Тренто, Италия

  • Франческа Албонико,
  • Клаудия Барели,
  • Давиде Албанезе,
  • Матия Маника,
  • Ерика Партел,
  • Фауста Росо,
  • Силвия Рипелино,
  • Масимо Пиндо,
  • Клаудио Донати,
  • Алфонсо Зекони

Фигури

Резюме

Цитат: Albonico F, Barelli C, Albanese D, Manica M, Partel E, Rosso F, et al. (2020 г.) Суровото мляко и фекалната микробиота на алпийските млечни крави в търговската мрежа варира в зависимост от стадото, съдържанието на мазнини и диетата. PLoS ONE 15 (8): e0237262. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237262

Редактор: Алекс В. Чавес, Университетът в Сидни, АВСТРАЛИЯ

Получено: 27 март 2020 г .; Прието: 22 юли 2020 г .; Публикувано: 6 август 2020 г.

Наличност на данни: Наборът от данни, генериран за това проучване, е публично достъпен на https://figshare.com/s/23c818dc250a18ea2451.

Финансиране: Италианският Фондация Cassa di Risparmio di Trento e Rovereto (CARITRO) подкрепи финансово това проучване с безвъзмездна финансова помощ за проекта MASTIRISK на FA и HCH.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Материали и методи

Вземане на проби

Биоинформативна обработка

16S rRNA генни последователности бяха обработени с помощта на софтуера с отворен код MICCA (v1.6) [38]. Припокриващите се сдвоени четения са събрани, като се използва процедурата, описана от Edgar и Flyvbjerg през 2015 г. [39]. Двойките с дължина на припокриване по-малка от 80 bp и с повече от 32 несъответствия бяха отхвърлени. След подрязване на грунд, отчитането напред с по-малко от 400 bp и с очаквана честота на грешки над 0,75% бяха изхвърлени. Четенията с по-малко от 60% идентичност на последователностите, присъстващи в базата данни на Greengenes (v. 13_8) [40], групирани при 85% сходство, бяха отхвърлени. OTUs бяха изведени, използвайки алтернативна алчна стратегия de novo, използвайки ограничение от 97% сходство. Получените представители на всяка OTU бяха класифицирани с помощта на класификатора Ribosomal Database Project (класификатор RDP, версия 2.12 [41]).

Паразитологичен анализ на изпражненията

За всяка прясна фекална проба се оценява наличието на хелминтни яйца и протозойни кисти, като се използва стандартна процедура за плаване. Всяка проба се смесва в пестик с 30 ml плаваща среда (наситен разтвор на захар и натриев нитрат), преминава през 1 mm филтър и се центрофугира при 4000 об/мин в продължение на пет минути в 15 ml стъклена епруветка. За всяка проба бяха приготвени две епруветки. След центрофугиране се добавя плаваща среда, докато епруветките се напълнят (приблизително 1 ml). Яйцата се събират от повърхността на всяка тръба с помощта на стъклен предмет. Слайдовете бяха наблюдавани при 10X и 40X увеличение с помощта на оптичен дисекционен микроскоп, а яйцата бяха идентифицирани по видове с помощта на ключове, предоставени от Soulsby [42] и Sloss and Kemp [43].

Обработка на данни и статистически анализи

Анализите надолу по веригата бяха извършени с помощта на R с филосек [44] и вегански пакети. След като субклиничните маститни проби бяха премахнати (вж. По-горе), останалите проби бяха разредени (без подмяна) при 2000 четения на проба, в резултат на което седем допълнителни проби бяха изхвърлени. Фекалните проби бяха разредени (без замяна) при 18 500 четения на проба, което доведе до изхвърляне на една проба. Оценката на стандартните индекси на алфа и бета разнообразие и анализ на основните координати (PCoA) бяха извършени с помощта на библиотеката R phyloseq.

Декларация за етика

Това проучване е проведено с проби от десет търговски млечни ферми, разположени в Трентино с разрешение от участващите фермери. За неинвазивните изследвания във фермите не се изисква надзор на етична комисия съгласно италианското и провинциалното законодателство. Авторите потвърждават, че по никакъв начин не са обезпокоили животните и вземането на проби от сурово мляко и фекалии е проведено по неинвазивни методи в съответствие с одобрените насоки на ветеринарните лекари във фермата. Бяха спазени всички приложими институционални и/или национални насоки за грижите и използването на животните.

Резултати

Таксономична класификация на суровото мляко и фекалната микробиота

От 76 проби мляко общо 70 бяха секвенирани успешно и след разреждане 63 бяха на разположение за биоинформатични анализи. Сред 25-те таксономично идентифицирани фила в проби от сурово мляко доминиращите са Firmicutes (средно количество 55,3%), следвани от Bacteroidetes (13,7%), протеобактерии (11,6%) и актинобактерии (11,3%). Останалите фили се характеризират с относително изобилие под 1% (таблица S1). На ниво семейство (фиг. 1А), Ruminococcaceae (средно изобилие 14,1%) са най-многобройни, следвани от Lachnospiraceae (8,8%) и Staphylococcaceae (5,7%). Докато доминиращите родове включват Staphylococcus (средно изобилие 4.7%) и Corynebacterium (4.5%), последвани от Clostridium XI (2.1%), Bacteroides (2.1%), Clostridium XIVa (1.8%), Acinetobacter (1.6%) (Фигура 2А). Некласифицираните OTU в млякото на това ниво са 39,8%, много по-малко от тези в изпражненията (65,2%).

Относително изобилие от най-многобройните семейства на алпийски млечни краве сурово мляко (а) и фекални (б) проби. Средното относително изобилие е представено в горните панели, докато тяхната променливост, изразена като интерквартили (IQR), е показана в долните панели.

Относително изобилие на най-разпространените родове от алпийски млечни краве сурово мляко (a) и фекални (b) проби в десет стада, или хранени традиционно (TF), или с унифицирано (UF) в провинция Тренто, Италия.

Всички 100 фекални проби бяха успешно секвенирани и само една проба беше отстранена след разреждане. Шестнадесет фила са таксономично разпределени във фекалиите (таблица S2), като Firmicutes (средно изобилие 51,2%) и Bacteroidetes (38,4%) представляват двете най-доминиращи фили, следвани от протеобактерии (2,6%) и спирохети (1,3%). На това ниво бяха открити много малко некласифицирани OTU (3,3% срещу 2,1% в суровото мляко). Подобно на суровото мляко, Ruminococcaceae (24,7%) и Lachnospiracee (10,4%) са двете най-разпространени семейства във фекални проби (фиг. 1В), следвани от Prevotellaceae (7,6%) и Bacteroidaceae (7,4%). Всички останали семейства са били под 5%; некласифицираните OTU на това ниво са били 28,6% (срещу 13,8% в суровото мляко). Родовете Bacteroides (7.3%), Alistipes (3.9%), Clostridium XIVa (2.7%), Paraprevotella (2.2%), Phascolarctobacterium (1.7%), Prevotella (1.5%), Treponema (1.3%) и Roseburia (1%) доминирани (фиг. 2В) фекални проби. Некласифицираните OTU на ниво род са били 65,2% (срещу 39,8% в суровото мляко).

Богатство на микробиота на сурово мляко и фекални проби

Оценките за богатство (алфа разнообразие) варират значително между отделните индивиди; общият брой на наблюдаваните OTU в проби от сурово мляко варира от 76 до 609 (Фигура 3А; Таблица S3), докато стойностите на обратния индекс на Симпсън варират от 1,6 до 130,3 (Фигура 4; Таблица S3).

Сцена за цигулка на общия брой наблюдавани OTU на сурово мляко от алпийски млечни крави (а) и фекални (б).

Кутия от наблюдавани стойности на обратния индекс на Симпсън за мляко и фекална микробиота в десет стада, хранени по традиция (TF) или с унифицирана храна (UF) в провинция Тренто, Италия. Хоризонталните пунктирани линии представляват средните стойности за всяка съответна микробиота. Точките са наблюдения, които не са включени между мустаците.

Фекалните проби също показват висока интра-индивидуална вариация в богатството на микробиота, представена както от броя на наблюдаваните OTU (вариращи между 714 и 1 581; Фигура 1B; Таблица S4), така и от обратния индекс на Симпсън (21,5 до 167,1; Фигура 4; S4 Таблица). Средните стойности на обратните индекси на Симпсън на сурово мляко са значително по-ниски от тези на изпражненията (средно = 86,4; df: 151,6, t-стойност: -5,575, P Таблица 1. Средни LMM оценки на параметрите на многомоделно извеждане на микробиота от сурово мляко състав.

Вместо това, богатството на фекални микробиоти се обяснява с диета, средно UF диетата се свързва с по-голямо разнообразие, последвано от дата на отелване и инфекция с кокцидии (Таблица 2). Корелацията на Пиърсън между наблюдаваните и монтираните стойности, изчислени чрез усреднени по модела параметри, е 0,33 (df = 97, P Таблица 2. Среднолинейни смесени модели (LMM) оценки на параметрите на многомоделно извеждане на състава на фекалната микробиота.

LM анализът на състава на микробиота (също базиран на обратния индекс на Симпсън) показа, че изричното разглеждане на „стадото“ като ковариати (таблица S5 и таблица S6) подобрява ефективността на модела и за двете млека (корелация на Пиърсън = 0,68, df = 61, P - 4; Фигура 5А; Таблица S7). Първата основна координата (PC) на PCoA (отдалечени крави от лявата страна на фигура 5А) се задвижва главно от по-голямото изобилие на Staphilococcaceae (фигура 5В), докато по-голямата част от останалите крави (клъстер в горния десен фигура 5А) имат по-голямо изобилие от девет други семейства, особено Ruminococcaceae, Bacteroidaceae и Prevotellaceae (Фигура 5В). Второто РС се обуславя главно от разликите в три бактериални семейства Xanthomonadaceae, Pseudomonadaceae и Flavobacteriaceae (Фигура 5С).

(а) Основен координатен анализ (PCoA) на разстоянията между пробите, измерени с помощта на различие между Bray-Curtis; Семейства, които стимулират променливостта на състава на микробиота в сурово мляко в първия (b) и втория (c) основен компонент. Цветните точки идентифицират крави от десет различни стада, хранени традиционно (TF) или с унифицирана храна (UF) от провинция Тренто, Италия.

По същия начин, за фекални проби, тестът PERMANOVA показа, че сред всички разгледани параметри само „стадо“ е статистически значимо (P −4; Фигура 6A; S8 Таблица). Първият компютър (отдалечени крави от дясната страна на фигура 6А, главно от стада TF3, TF4 и TF5) се обяснява с по-голямото изобилие на Lachnospiraceae и Succinivibrionaceae, докато по-голямата част от кравите, групирани вляво, се характеризират с по-голямо изобилие на Bdellovibrionaceae, Verrucomicrobiaceae, Desulfovibrionaceae и Rikenellaceae (Фигура 6В). Освен това изпражненията на млечните крави в горния ляв ъгъл на графиката (главно от стада UF2, UF3, UF4 и TF5 на фигура 6А) се характеризират с по-голям брой Bacteroidaceae и Prevotellaceae, докато тези от стада TF2 и UF5 имат повече Desulfovibrionaceae, Bdellovibrionaceae и Verrucomicrobiaceae. Измерванията на бактериалното богатство показват, че фекалните проби с по-голям брой OTU (фиг. 6D) също имат по-голяма ентропия на Шанън (фиг. 6Е).

(а) Основен координатен анализ (PCoA) на разстоянията между пробите, измерени с помощта на различие между Bray-Curtis; Семейства, които стимулират променливостта на състава на фекалната микробиота в първия (b) и втория (c) основен компонент; Разстояние на пробата въз основа на броя на наблюдаваните OTU (d) и ентропията на Shannon (e). Цветните точки идентифицират крави от десет различни стада, хранени традиционно (TF) или с унифицирана храна (UF), събрани в провинция Тренто, Италия.

Дискусия

Доколкото ни е известно, това е първата голяма оценка на суровото мляко и фекалната микробиота при търговски (неекспериментални) млечни крави. Проучихме почти 100 здрави крави от 10 малки (неинтензивни) алпийски ферми и проучихме как вътрешните и външните фактори могат да повлияят на тяхното богатство и състав на микробиотата. Въпреки че варирането между отделните крави и за двата типа проби беше очевидно, ние показахме, че „стадото“ е най-важният фактор, влияещ върху индивидуалните различия в богатството и състава на микробиотата както в суровото мляко, така и в изпражненията. Такива знания могат да повлияят на използването на манипулации с микробиоти за икономически или ветеринарни цели.

Въпреки че принадлежат към различни ферми, породи и режими на хранене, всички проби от сурово мляко и фекалии от това проучване са доминирани от вида Firmicutes, последван от Bacteroidetes и Proteobacteria. Този резултат е в съответствие с публикуваните по-рано изследвания на говеждо сурово мляко [2, 4, 11, 48] и фекални проби [16, 18, 21, 24] в експериментални стада или много по-малък брой млечни крави. Освен това тези три вида са най-разпространени в различни видове бозайници, като примати на хора и нечовеци, лабораторни мишки [49–53], както и диви тревопасни животни (гигантска панда [54]; сика елен [55 ]; горски мускус елен [56]). В допълнение, ниското относително изобилие от протеобактерии, открито във фекалните проби от това проучване (2,5%) в сравнение с Firmicutes и Bacterioides (89,6%), може да отразява здравословното състояние на кравите. Съобщава се, че здравите крави имат по-малко от 4% протеобактерии, докато увеличаването на това относително изобилие е свързано с подостра руминална ацидоза [24, 57, 58].

На ниво семейство Ruminococcaceae и Lachnospiraceae доминират както в млечните, така и в фекалните проби. Въпреки важната си роля за разграждането на нишестето и фибрите [15, 18], тези две семейства са свързани със здравето на червата при различни видове бозайници, включително коне [65], котки и кучета [66, 67] и лабораторни мишки [48, 68 ], както и говеда [21]. Интересното е, че въпреки различията между индивидите и фермите, за първи път отбелязваме, че същите доминиращи семейства се срещат и в суровото мляко, което има важни последици за здравето и храненето на телетата и човешките черва. Други многобройни семейства, които съобщихме в суровото мляко, бяха Staphylococcaceae, често възстановявани от млечни крави [69], и Corynebacteriaceae, която има широк спектър от ферментативни способности [70]. Сред най-разпространените семейства във фекалиите открихме Prevotellaceae, които варират в широки граници в отговор на диетични лечения [19, 71] и Bacteroidaceae, включително някои видове Bacteroides, за които е известно, че разграждат компонентите на клетъчната стена [72].

Интересното е, че във фекални проби наблюдавахме, че пробите, характеризиращи се с по-голям брой OTU, са по-сходни помежду си (имат тенденция да се групират заедно) и имат по-висока ентропия, докато пробите, характеризиращи се с по-малко OTU, са най-променливите, с по-ниска ентропия. Няколко автори са показали, че по-стабилните и продуктивни общности, включително микробиотата на човешките черва [88], но също и зоопланктонът [89, 90], имат по-добра устойчивост на патогени. Други автори отбелязват, че намаляването на богатството на микробиота често придружава болестта, а по-ниското богатство може да доведе до по-ограничена способност на микробиотата да реагира на различни стресори [91, 92]. По-ниското богатство обаче не винаги е свързано с по-ниска годност при нечовешки животни [93, 94] и всъщност тук не открихме връзка с наличието на кокцидии и обратен индекс на Симпсън. Следователно „защитният“ капацитет на много разнообразна микробиота може да зависи от вида на патогена. Необходима е по-нататъшна работа за изясняване на ролята на разнообразието на микробиоти и защита срещу паразити.

Освен стадото, важни предиктори за инверсните индекси на Симпсън са процентното съдържание на мазнини за сурово мляко и диетата както за сурово мляко, така и за фекални проби. Интересното е, че богатството на млечна микробиота е силно свързано със съдържанието на млечни мазнини. Тъй като съвременните породи са избрани за по-голямо количество мляко, това доведе до мляко с по-ниско съдържание на мазнини. Млякото с ниско съдържание на мазнини също се счита за „по-здравословен“ избор от днешните потребители. Нашият резултат предполага значението на мазнините в богатството на млечната микробиота; по този начин, ако такова разнообразие се счита за полезно за здравето, тогава намаляването на мазнините може да има ефект както върху здравето на животните, така и върху храненето на хората. Вместо това, връзката между богатството и диетата не е изненадваща, тъй като много автори разглеждат диетата по отношение на формулирането на диетата, управлението на храненето и концентрацията на фекално нишесте като най-големите фактори, променящи фекалните бактериални съобщества [13, 18, 19, 71].