Резюме

ОБЕКТИВЕН-Доказано е, че топлинната обработка и свръхекспресията на протеин от топлинен шок 72 (HSP72) предпазват от инсулинова резистентност, индуцирана от високо съдържание на мазнини, но малко се знае за основния механизъм или целевата тъкан на действието на HSP. Целта на това проучване е да се определи дали in vivo топлинната обработка може да предотврати инсулиновата резистентност на скелетните мускули.

обработка

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯ -Мъжки плъхове Wistar са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини (60% калории от мазнини) в продължение на 12 седмици и са получавали термична обработка на долната част на тялото (41 ° C за 20 минути) веднъж седмично.

РЕЗУЛТАТИ—Нашите резултати показват, че топлинната обработка измества метаболитните характеристики на плъховете на диета с високо съдържание на мазнини към тези на стандартна диета. Топлинното лечение подобрява глюкозния толеранс, възстановява стимулирания от инсулин транспорт на глюкоза и увеличава инсулиновата сигнализация в мускулите на soleus и extensor digitorum longus (EDL) от плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Термичната обработка доведе до намалено активиране на Jun NH2-терминална киназа (JNK) и инхибитор на κB киназа (IKK-β), стрес кинази, замесени в инсулинова резистентност, и повишено регулиране на HSP72 и HSP25, протеини, които преди това са инхибирали JNK и IKK-β активиране, съответно. Активността на митохондриалната цитрат синтаза и цитохром оксидазата леко намалява с диетата с високо съдържание на мазнини, но топлинната обработка възстановява тези дейности. Данните от L6 клетки предполагат, че един пристъп на топлинна обработка увеличава консумацията на митохондриален кислород и окисляването на мастните киселини.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ—Нашите резултати показват, че топлинната обработка предпазва скелетните мускули от инсулинова резистентност, предизвикана от диета с високо съдържание на мазнини, и предоставя сериозни доказателства, че индуцирането на HSP в скелетните мускули може да бъде потенциално терапевтично лечение за индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност.

Инсулиновата резистентност е свързана с много свързани здравни усложнения, включително диабет тип 2 и сърдечни заболявания. Неотдавнашно проучване демонстрира индукция на естествената защитна система на тялото, протеини от топлинен шок (HSP), предпазва от индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност (1). По-ранни проучвания при пациенти с диабет тип 2 показаха, че терапията с гореща вана подобрява гликемичния контрол (2) и обратната корелация между експресията на иРНК на HSP72 и степента на диабет тип 2 (3). Понастоящем няколко HSP-индуциращи лекарства са в процес на разследване или в клинични изпитвания за диабетна невропатия и невродегенеративни заболявания (4,5) и могат да бъдат разгледани за превенция на инсулинова резистентност. Малко обаче се знае за механизма, който стои зад тази новооткрита роля на HSP72, дали други индуцируеми HSP могат да бъдат защитни срещу инсулинова резистентност, или основната прицелна тъкан на HSP действие.

Скелетните мускули са основната тъкан, отговорна за усвояването на глюкоза, медиирано от цялото тяло (6,7). HSP се изразяват в скелетни мускули и са силно индуцирани с тренировъчни упражнения (8,9). Доказано е, че свръхекспресията на HSP72 намалява атрофията на скелетните мускули и оксидативния стрес с възрастта (10). Следователно скелетните мускули са логичен избор като целевата тъкан за ползите от свръхекспресията на HSP. Предишни проучвания показват, че базалните нива на HSP се различават между типовете мускулни влакна с бавно потрепващи окислителни мускули, които имат по-висока конститутивна експресия на HSP, отколкото гликолитичните мускули с бързо потрепване (11). За разлика от това, мускулите с бързо потрепване притежават по-голям капацитет за индукция на HSP в отговор на физиологични стресори и упражнения (11,12). Не е сигурно дали HSP биха били еднакво ефективни като медиатори на инсулиновото действие при мускули с бавно и бързо потрепване.

Целта на настоящото проучване е да се определи дали седмичната in vivo термична обработка може да предотврати инсулинова резистентност на скелетните мускули при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини и изясни механизмите на HSP функцията в скелетните мускули. Ние предположихме, че топлинната обработка позволява на скелетните мускули да се адаптират и да се противопоставят на развитието на инсулинова резистентност в резултат на повишена експресия на HSP. Нашите открития показват, че топлинната обработка предотвратява инсулиновата резистентност на скелетните мускули и активирането на стрес киназата, докато повишената консумация на кислород и окисляването на мастни киселини в L6 клетките предполагат, че топлинната обработка може да подобри митохондриалната функция.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

[14 С] манитол и 2-дезокси [1,2- 3 Н] глюкоза са закупени от American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO). Използваните антитела включват фосфо-Thr183/Tyr185 и обща Jun NH2-терминална киназа (JNK), фосфо-Ser473 и общ Akt, и инхибитор на κBα (IkBα) (Cell Signaling, Beverly, MA); HSP72, фосфо-Ser82 и общ HSP25, HSP60 и цитохром с (Stressgen, Victoria, BC, Канада); тубулин (Sigma, Сейнт Луис, Мисури); цитохром оксидаза IV субединици I и IV (Molecular Probes, Eugene, OR); цитрат синтаза (Alpha Diagnostic, Сан Антонио, Тексас); разединяване на протеин-3 (UCP-3; Chemicon International, Темекула, Калифорния); пероксизомен пролифератор-активиран рецептор (PPAR) -γ коактиватор 1 α (PGC-1α; Calbiochem, Сан Диего, Калифорния); фосфо – Tyr612-IRS-1 (Biosource, Camarillo, Калифорния); и IRS-1 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). [3 H] палмитат е закупен от Perkin Elmer (Waltham, MA), инсулинови ELISA комплекти от Alpco diagnostika (Salem, NH) и всички други реагенти от Sigma.

Експериментални животни и лечение.

Мъжки плъхове Wistar (100–130 g) от Charles River Laboratories (Wilmington, MA) бяха настанени в контролирана температура (22 ± 2 ° C) стая с 12:12 цикъл светлина/тъмнина. Животните са били хранени ad libitum в продължение на 12 седмици със стандартна диета с чау (8604; Harlan Teklad, Madison, WI) или диета с високо съдържание на мазнини [60% калории от мазнини, съдържащи свинска мас и царевично масло и 20% калории от въглехидрати (13)]. Експериментите са проведени 48 часа след последната топлинна или фалшива обработка и плъховете са гладували 12 часа преди експерименталните процедури. Всички протоколи бяха одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните към Медицинския център на Университета в Канзас.

Термична обработка in vivo.

Веднъж седмично хранените с високо съдържание на мазнини животни се упояват с натриев пентобарбитал (5 mg/100 g телесно тегло) и долната част на тялото се потапя във водна баня. Температурата на тялото постепенно се повишава и се поддържа между 41 и 41,5 ° C в продължение на 20 минути, както се наблюдава с ректален термометър. Фиктивната обработка поддържа температурата на сърцевината на 36 ° C. След лечението се прилагат 5 ml 0,9% физиологичен разтвор за предотвратяване на дехидратация. Предварителните експерименти в нашата лаборатория установяват, че една термична обработка на седмица поддържа увеличаване на експресията на HSP72 и избягва потенциалното инхибиране на HSP чрез многократна топлинна обработка (14).

Тест за интраперитонеален глюкозен толеранс.

Интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза (IPGTT) е направен през седмица 11, 48 часа след последното топлинно/фалшиво третиране. Плъховете, които гладуват през нощта, се упояват и им се дава глюкозен товар от 2 g/kg телесно тегло. За да се предотврати дехидратация, след GTT са приложени 5 ml 0,9% физиологичен разтвор.

Имуноблотинг, глюкозен транспорт и анализ на киназа.

През 12-та седмица плъховете бяха анестезирани за отстраняване на мускулите на soleus и extensor digitorum longus (EDL). Мускулите бяха разделени надлъжно, за да се позволи адекватна дифузия на субстратите (11,15). Две мускулни ленти на плъх бяха оценени за транспортиране на глюкоза и две ленти бяха инкубирани със или без 1 mU/ml инсулин в продължение на 20 минути и замразени за Western blot анализ, както беше описано по-горе (11). Western blots първо се изследват за фосфорилирани протеини и след това се отстраняват за обща експресия на протеини. Транспортната активност на глюкозата се определя, като се използват 1,5 μCi/ml 2 [1,2-3 Н] дезоксиглюкоза и 0,2 μCi/ml [14 С] манитол (11,16,17). Нивата на активност на инхибитора на кВ киназа (IKK-β) в цело-клетъчни лизати се анализират, както е описано по-рано (18). Нивата на фосфорилирани IkBα бяха открити чрез Western blot анализ.

Инкубация на KNK437.

Мускулите на солеус са изолирани от 3-месечни плъхове Fischer 344 и са подложени на 42 ° C топлинна или 35 ° C фиктивна обработка за 30 минути in vitro. Подгрупите мускули бяха инкубирани в 100 μmol/l HSP70 инхибитор KNK437 (Calbiochem) и стимулирани с 10 μg/ml анизомицин (Calbiochem). HSP72 и p-JNK/JNK бяха открити чрез Western blot анализ.

Митохондриална ензимна активност.

Активността на цитрат синтазата се оценява в мускулни лизати (приготвени в буфера за клетъчна екстракция, използван за имуноблотинг; Biosource), като се използва модифициран протокол (19) от Srere (20). Абсорбцията се записва при 405 nm на всеки 20 s за 3 минути при 30 ° C, като се използва MRXII четец за микроплаки и кинетичен софтуерен пакет (Dynex Technologies, Chantilly, VA). Линейната част от реакционната крива се използва за изчисляване на нивата на активност на цитрат синтаза, нормализирани до нивата на експресия на протеин цитрат синтаза, в микромоли на грам в минута.

За анализа на цитохром оксидазата 140 μg мускулен лизат в 20 mmol/l калиев фосфатен буфер (pH 7,0) и 0,2 mg додецил малтозид се затопля до 30 ° C (21). Реакцията беше инициирана чрез добавяне на 25 μmol/l редуциран цитохром c и окислението на редуциран цитохром c беше последвано за 2 минути при 550 nm на спектрофотометър от серия DU (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Максималното окисление на цитохром с се определя чрез добавяне на калиев ферицианид. Активността беше изчислена и нормализирана до нивата на експресия на протеин на цитохром с оксидаза 4 (Cox-4) (секунди на милиграм протеин).

Измерване на нивата на консумация на кислород.

L6 миобласти от American Type Culture Collection (Manassas, VA) се култивират в модифицираната среда на Dulbecco Eagle, допълнена с 10% фетален говежди серум, 100 единици/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин. Пет до шест дни след диференциацията, L6 клетките се третират с 30 ng/ml тумор некротизиращ фактор-α (TNF-α) самостоятелно или в комбинация с топлинна обработка (43 ° С за 20 минути) и експерименти се провеждат 24 часа по-късно. Скоростта на консумация на O2 се определя с помощта на респирометър с висока разделителна способност Oroboros Oxygraph-2K (Инсбрук, Австрия). След стабилизиране на изходното ниво последователно се инжектират инхибитори на дихателната верига: 1 μg/ml олигомицин, 3 μmol/l карбонил цианид 4- (трифлуорометокси) -фенил-хидразон, 1 μmol/l ротенон и 2 μmol/l миксотиазол. Всички стойности бяха нормализирани до съдържание на протеин и немитохондриалните дихателни честоти бяха извадени.

Скорости на окисление на мастните киселини.

Окисляването на мастни киселини се извършва, както е описано по-рано (22). Накратко, L6 миотръбите се обработват термично или фалшиво и се излагат на 200 μmol/l палмитат, съчетан със 7,5% BSA (тегло/обем) в продължение на 72 часа. Втора термична обработка беше направена през последните 24 часа палмитатна обработка. Клетките се промиват с PBS и се инкубират с 200 μl 125 μmol/l [3 H] разтвор на палмитат-BSA (1 mCi/ml запас), допълнен с 1 mmol/l карнитин в продължение на 2 h при 37 ° C. След инкубация, разтвор от всяка ямка се добавя към 200 μl студена 10% TCA и се центрофугира при 3 300 rpm в продължение на 10 минути. След неутрализиране с 6 N NaOH, сместа се пуска през колона от смола DOWEX, за да се отделят междинните продукти за окисление на мастните киселини и 3 Н-белязана вода. Сцинтилационната течност се добавя към потока и се отчита 3 Н-CPM (отчитания в минута). Скоростта на окисляване на мастните киселини се нормализира до съдържанието на протеин и се изразява като наномоли на час на милиграм.