Молекулярна
Лекарство
Доклади

• Последните две години
• Обща сума

• Миналата година 0
• Обща сума

• Миналият месец
• Изминалата година
• Обща сума

• Binggui Zhang
• Rongqi Wang
• Jinghua Du
• Джингя Ниу
• Руй Джанг
• Шунджианг Сю
• Xuemin Niu
• Цинфу Джанг
• Юемин Нан

Тази статия се споменава в:

Резюме

Въведение

Безалкохолният стеатохепатит (NASH), част от спектъра на безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD), се характеризира с инсулинова резистентност и дислипидемия и може да прогресира до фиброза, цироза, чернодробна недостатъчност и хепатоцелуларен карцином (1). Напоследък NASH е признат за водеща причина за тежка чернодробна дисфункция и в резултат привлича все по-голямо внимание. Успешната профилактика и лечение на NASH на ранен етап до голяма степен зависи от подобреното разбиране на основните молекулни механизми, участващи в заболяването. Различни фактори, включително дисрегулация на липидния метаболизъм, инсулинова резистентност, имунен отговор, възпаление и оксидативен стрес, допринасят за патогенезата на NASH (2,3).

Диетата с дефицит на метионин-холин (MCD) е често срещан метод, използван при лабораторни животни за индуциране на NASH, причиняващ чернодробна стеатоза с възпаление, което е морфологично идентично с NASH при хора (4,5). Използвайки този модел, е доказано, че оксидативният стрес допринася за прогресията на NASH чрез стимулиране на имунните отговори, което показва възможната роля на адаптивния имунитет в патогенезата на заболяването (6). Точната причина за стеатохепатит обаче остава слабо разбрана.

МикроРНК (miRNAs) са основни за диабета и NAFLD и коригирането на експресията на miRNA чрез регулиране или инхибиране се предлага като обещаващо лечение за метаболитен синдром и може да облекчи прогресирането на заболяването (7). miRNAs са клас едноверижни некодиращи малки РНК, с дължина обикновено 22 нуклеотида, които регулират протеиновата експресия на посттранскрипционно ниво, чрез пълно или частично свързване с кодиращи протеини иРНК (8). В момента са идентифицирани 2042 зрели човешки miRNAs (miRBase 19.0, 17 октомври 2012 г.), които регулират над една трета от човешките гени (9). miRNAs са свързани с множество патофизиологични събития, като развитие на тъкани, диференциация, клетъчна пролиферация и апоптоза (10,11).

Съобщава се, че miR-33a и miR-33b участват в контрола на хомеостазата на холестерола и липидите чрез регулиране на експресията на протеин, свързващ протеиновите регулаторни елементи (SREBP) (12). В допълнение беше установено, че miR-375 намалява секрецията на инсулин и влияе върху инсулиновата сигнализация надолу по веригата (13). За отбелязване е, че нокдаунът на miR-122, изобилна miRNA, специфично експресирана в човешкия черен дроб, намалява репликацията на протеин на вируса на хепатит С, докато индуцира експресия на хем оксигеназа 1 (14). Освен това, регулирането на miRNA-221/222 активира звездни клетки и насърчава прогресията на чернодробната фиброза (15). Съобщава се също така, че изобилието на miR-199a-5p/3p корелира с прогресията на чернодробната фиброза (16).

За отбелязване е, че циркулиращите miRNAs се предлагат като полезни инструменти за диагностика на чернодробни заболявания (17,18). Промените в нивата на експресия на miR-29c, miR-34a, miR-155 и miR-200b, чернодробни miRNAs, са свързани с разлики в патофизиологичните и патоморфологичните характеристики на NASH (19). Освен това, в проучване за скрининг за променени нива на експресия на чернодробни miRNAs, свързани с NASH, се съобщава, че общо 23 miRNAs са недостатъчно експресирани или свръхекспресирани в NASH, като се знае, че прогнозираните цели на тези miRNAs влияят върху клетъчната пролиферация, метаболизма, транслацията на протеини, апоптоза, възпаление и оксидативен стрес (20).

В настоящото проучване нивата на експресия на чернодробни miR-199a-5p, miR-122 и miR-221 бяха изследвани в миши модел на NASH, използвайки верижна реакция на полимеразна обратна транскрипция (RT-PCR). Целевите гени на miR-199a-5p бяха предсказани от биоинформативни инструменти, включително TargetScan 6.2, miRanda и PITA. Ядреният рецептор 1 на ядрен рецептор (NCOR1), с функции, свързани с NASH, се появи като целеви ген miR-199a-5p, предвиден от всички алгоритми. NCOR1 е голям, многодоменен протеин, който се набира от ядрени рецептори за медииране на транскрипционна репресия и е замесен в епигенетичната регулация на циркадната и метаболитната физиология чрез активиране на хистонова деацетилаза 3 (21) и други физиологични пътища, включително промоция на рака (22).

В настоящото проучване NCOR1 е изследван in vitro чрез заглушаване и свръхекспресия на miR-199a-5p в LX-2 човешки чернодробни звездни клетки (HSC).

Материали и методи

Животни, диети и експериментален дизайн

Мъжки мишки C57BL/6J, на възраст шест седмици, са получени от Експерименталния център за животни към Китайската академия на медицинските науки (Пекин, Китай) и са настанени под 12 h цикъл светлина/тъмнина при 24 ° C, със свободен достъп до пречистени вода и стандартна диета. След две седмици аклимация, мишките бяха разделени на случаен принцип в две групи, хранени или с MCD диета (ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) или с нормална диета, допълнена с холин битартат (2 g/kg) и DL-метионин (3 g/kg; ICN Biomedicals) в продължение на осем седмици. Храната за животни се съхранява при 4 ° C преди употреба и е налична ad libitum. В края на осемседмичната експозиция, кръвни проби от ретро-орбитални вени бяха събрани бързо за биохимичен анализ и след това мишките бяха умъртвени чрез цервикална дислокация. В края на осемседмичното излагане мишките бяха умъртвени. Черният дроб се изрязва, замразява се бързо в течен азот и се съхранява при -80 ° C до употреба или се фиксира в 10% формалин за хистологичен анализ. Всички експериментални процедури са одобрени от Комитета по етика на експериментите с животни към Медицинския университет в Хъбей (Шицзячжуан, Китай).

Биохимичен анализ

Нивата на серумна аланин аминотрансфераза (ALT) и аспартат аминотрансфераза (AST; Shanghai Kehua Bio-Engineering Co., Ltd., Шанхай, Китай), надеждни показатели за чернодробно възпаление, са измерени с помощта на автоматичен химически анализатор Olympus AU5400 (Olympus Corporation, Tokyo, Япония) съгласно инструкциите на производителя.

Хистологичен анализ

Вградените в парафин чернодробни секции (5 μm) бяха оцветени с хематоксилин и еозин и трихром на Masson за оценка на чернодробната стеатоза и фиброза, както е описано по-горе (23,24). Хистологичното оценяване за NAFLD е проведено, както е определено от критериите на Комитета по патология на Клиничната изследователска мрежа за неалкохолен стеатохепатит (25).

RT-PCR и иРНК анализ

Общата РНК беше извлечена от чернодробни тъкани, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и количествено определена с помощта на спектрофотометър NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Синтезът на cDNA беше извършен с използване на 2 μg обща РНК и обратна транскриптаза на вируса на миша левкемия на Молони с олиго dT праймери (Fermentas, Burlington, ON, Канада) или набор от праймери miRNA RT (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Гуанджоу, Китай). RT-PCR се извършва на ABI 7500 PCR система (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ), използвайки SYBR-Green PCR комплект (Beijing CoWin Biotech Co., Ltd., Beijng, China). Експресионните нива на miRNAs бяха нормализирани до тези на U6 малката ядрена РНК и нивата на експресия на целевите гени бяха нормализирани до тези на β-актина. Относителното ниво на експресия на всяка miRNA и целевия ген беше оценено чрез метода 2 -ΔΔCt (26). Всички RT-PCR реакции се провеждат в три екземпляра. Използваните праймери бяха както следва: NCOR1 напред: 5′-CCCATTTCCAGCGTGTTAGTG-3 ′ и обратен: 5′-AAGGTGAAGCAT TTTGGTCATCT-3 ′; β-актин напред: 5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3 ′ и обратен: 5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3 ′.

Биоинформатичен анализ

Както беше определено от предишно проучване (27) и Omnibus за генна експресия, miR-199a-5p беше избран за изчислително прогнозиране, използвайки TargetScanMouse v6.2 (www.targetscan.org), за да генерира списък с целеви гени. За функционален анализ на цели miR-199a-5p е извършен анализ на обогатяване на предсказаните целеви гени, като се използва базата данни за анотации, визуализация и разследвано откриване (DAVID) (28). Анализът на обогатяването е извършен с всички известни термини на генната онтология (GO) и пътищата на Киото енциклопедия на гени и геноми (KEGG; www.genome.jp/kegg).

Уестърн блотинг

Пробите от тъкани бяха извлечени с помощта на радиоимунопреципитационен буфер за анализ, съдържащ 1% фенилметансулфонил флуорид, и белтъчните концентрации бяха измерени по метода на Брадфорд (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Проби с еднакви количества протеин (50 μg/гнездо) се разделят с помощта на SDS-PAGE и се прехвърлят в поливинилиден дифлуоридни мембрани (Amersham PLC, Amersham, UK) чрез електробиране. Мембраните бяха инкубирани една нощ при 4 ° С с първични заешки антитела срещу NCOR1 [разредени 1: 1000 във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS); Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA], трансформиращ растежен фактор (TGF) -β1 (разреден 1: 1000 в PBS; Abcam, Кеймбридж, Великобритания) или α-гладък мускулен актин (α-SMA; разреден 1: 1000 в PBS; Abcam). Сигналите бяха нормализирани до тези на β-актина, открити от антитела, закупени от Sigma-Aldrich (разредени 1: 1000 в PBS; Сейнт Луис, МО, САЩ). След инкубация с козе-анти-заешко IRDye800 вторично антитяло (Rockland, Gilbertsville, PA, USA), лентите, открити на мембраните, бяха количествено определени с помощта на инфрачервена камера Odyssey ™ (LI-COR Biosciences, Inc., Lincoln, NE, USA).

Клетъчна култура и трансфекция

LX-2 HSC са закупени от American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). HSC са основен фиброгенен тип клетки, които допринасят за натрупването на колаген по време на хронично чернодробно заболяване и представляват ценни инструменти за анализ на чернодробни заболявания. LX-2 клетки се култивират в модифицирана среда на Eagle на Dulbecco, допълнена с 10% фетален говежди серум, 100 U/ml пеницилин и 100 g/l стрептомицин при 37 ° C в овлажнена среда с 5% CO 2. Клетките се засяват с плътност 2 × 105 клетки/ml и се отглеждат до 50% сливане преди трансфекция с имитация на 100 nmol/l miR-199a-5p, инхибитор miR-199a-5p или съответните контроли (Guangzhou RiboBio Co ., Ltd.), използвайки Lipofectamine ® 2000 (Invitrogen Life Technologies). Трансфектираните клетки се култивират в продължение на 48 часа и се събират за обща екстракция на РНК и протеин. Пробите се съхраняват при -80 ° C за последваща употреба в RT-PCR или анализи с Western blotting. Всяко третиране се провежда в поне три повторения.

Статистически анализ

Фигура 1

Чернодробни секции на мишки C57BL/6J, хранени с контролни и MCD диети в продължение на осем седмици. (А) Оцветяване с хематоксилин и еозин; (Б) трихромно оцветяване на Masson. Оригинално увеличение, × 200. MCD, дефицит на метионин-холин.

• Преминаването от високомаслена към нискомаслена диета кара мишките да усещат симптоми на отнемане
• Насочена към ендоканабиноидната CB1 рецепторна система за лечение на затлъстяване при синдром на Prader-Willi -
• Какво ядат мишките - как да защитим дома си
• Тъканен азотосъхраняващ ефект на високо протеинова диета при мишки с или без третиран асцитен тумор
• Схемата на хранене на генетично затлъстели (obob) мишки - ScienceDirect