Йоширо Найто

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Хисаши Савада

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Макико Обоши

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Ая Фуджи

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Шиничи Хиротани

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Тошихиро Ивасаку

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Йошитака Окухара

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Акийо Егучи

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Дайсуке Морисава

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Мицумаса Оянаги

2 Отдел по коронарна болест на сърцето, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж в Хиого, Нишиномия, Япония,

Такеши Цуджино

3 Катедра по фармация, Университет по здравни науки в Хиого, Кобе, Япония,

Тору Масуяма

1 Сърдечно-съдов отдел, Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Хиого, Нишиномия, Япония,

Замислил и проектирал експериментите: YN TM. Изпълнени експерименти: YN TM HS MO AF SH TI YO AE DM MO TT. Анализирани данни: YN HS TM. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: YN TM. Написа хартията: YN TM.

Резюме

Въведение

Броят на пациентите с хронично бъбречно заболяване (ХБН) се увеличава и ХБН се свързва с повишен риск от внезапна смърт [1]. В същото време хипертонията е важен рисков фактор за прогресията на ХБН [2]. Тъй като хипертоничната нефропатия обикновено се прилага при ХБН, свързана с есенциална хипертония, струва си да се изследва патофизиологията на хипертоничната нефропатия.

Желязото е необходим елемент за живота и играе съществена роля в няколко метаболитни процеса. Въпреки това излишното натрупване на желязо ускорява реакцията на Фентон, което води до оксидативен стрес и увреждане на клетките. Интересното е, че се наблюдава анормално отлагане на желязо в тубулите на хронично бъбречно заболяване при хора [3] и животински модели на нефропатия [4] - [6]. В допълнение, наскоро съобщихме, че бъбречното натрупване на желязо и експресията на вътреклетъчни транспортни протеини на желязо, като трансферинов рецептор 1 (TfR1) и двувалентен метален транспортер 1 (DMT-1), се увеличават в тубулите на добре установената 5/6 модел на нефректомия плъх на ХБН. Освен това, ние показахме, че диетичното ограничаване на желязото намалява развитието на бъбречно увреждане при плъхове с модел на ХБН [7]. До голяма степен обаче не е известно дали желязото и вътреклетъчните транспортни протеини на желязо участват в патофизиологията на хипертоничната нефропатия. В допълнение, ефектите от ограничаването на желязото върху развитието на индуцирана от сол нефросклероза остават неизвестни.

В настоящото изследване ние изследваме дали желязото участва в развитието на хипертонична нефропатия и ефектите от ограничаването на желязото върху нефросклерозата при спонтанно хипертонични плъхове, натоварени с инсулт, натоварени със сол (SHRSP). Тук откриваме, че се наблюдава масивно натрупване на желязо и повишено съдържание на желязо в бъбреците на натоварен със сол SHRSP и че ограничаването на желязото отслабва развитието на хипертонична нефропатия при натоварен със сол SHRSP.

Материали и методи

Декларация за етика

Всички наши експериментални процедури бяха одобрени от Комитета за изследвания на животните към Медицинския колеж в Хиого (протокол № 13-036) и бяха извършени в съответствие с Насоките за експериментиране с животни, публикувани от Японската асоциация за лабораторни животински науки.

Модели на животни

Оценки на кръвното налягане, съдържанието на урина, кръв и бъбречно желязо

SBP се измерва чрез неинвазивна компютъризирана система за маншети за опашка (MK-2000, Muromachi Kikai) [8]. Концентрациите на общ белтък и желязо в урината се определят съответно чрез пирогалолов червен метод и атомно-абсорбционен метод [7]. Нивата на 8-хидрокси-2'-деоксигуанозин (8-OHdG) в урината се оценяват чрез анализ на ензимно свързан имунен сорбент (Японски институт за контрол на стареенето). Броят на периферните кръвни клетки, серумен BUN, серумен креатинин и серумни нива на желязо бяха определени, както беше съобщено по-рано [8]. Бъбречното съдържание на желязо се определя чрез атомна абсорбция [9].

Екстракция на РНК и количествена RT-PCR в реално време

Общата РНК беше извлечена от бъбреците и черния дроб, като се използва реагент TRIzol (Invitrogen) съгласно инструкциите на производителя. Общата РНК се третира с DNase и се транскрибира обратно в cDNA, като се използват произволни праймери (Applied Biosystems). PCR реакциите в реално време се провеждат, използвайки ABI PRISM 7900 с TaqMan Universal PCR Master Mix и TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) [9]. Нивата на тРНК бяха нормализирани до експресия на GAPDH ген. Тестовете за експресия на TaqMan са използвани като сонди и праймери за всеки ген, както следва: хем оксигеназа-1 (HO-1) (тест за анализ Rn01536933_m1), хепцидин (тест за анализ Rn00584987_m1), колаген тип III (номер за анализ Rn01437683_m1), трансформиране фактор на растеж-β (TGF-β) (ID за анализ Rn99999016_m1), CD68 (ID за анализ Rn01495634_g1), инхибитор на плазминогенен активатор тип 1 (PAI-1) (идентификационен номер Rn01481341_m1) и глицералдехид-3-фосфатеза на Hydro-Hydrogen № Rn99999916_m1).

Хистоморфометричен анализ

Бъбречните тъкани бяха фиксирани с буфериран 4% параформалдехид, вградени в парафин и нарязани на участъци с дебелина 4 µm. Периодичното киселинно оцветяване на Schiff и Masson’s трихром се извършва, като се използват серийни секции. Депозитите от железен желязо бяха оцветени с оцветяване с берлинско синьо. Гломерулните лезии и тубулните лезии се оценяват чрез полуколичествен резултат, като се използва методът, както е описано по-горе [10].

Имунохистохимичен анализ

Бъбречните срезове бяха имунохистохимично оцветени с първично миши анти-CD68 антитяло (AbD Serotec; разреждане 1∶1000), първично миши антидесмин антитяло (Dako; разреждане 1-50), първично миши анти-TfR1 антитяло (Zymed Laboratories; разреждане 1∶200), първичен заешки анти-DMT-1 с антитяло, реагиращо на желязо (Alpha Diagnostic; разреждане 1∶100), и първично заешко анти-хепцидин-25 антитяло (abcam; разреждане 1∶1000). Имуностените се визуализират с използването на конюгат авидин-биотин-пероксидаза и 3,3′-диаминобензидин субстрат. Всяка секция беше оцветена с хематоксилин. Количественото определяне на CD68 положителни клетки и десмин оцветяване се оценява, както е описано по-горе [7]. Оцветяването на dUTP с никел-край (TUNEL), медиирано от деоксинуклеотидил трансфераза, се извършва в съответствие с инструкциите на производителя (комплект за откриване на апоптоза in situ; TaKaRa). Разделът беше опетнен с и DAPI. Броят на TUNEL-положителните клетки се отчита, както е описано по-горе [7]. Част от бъбречните тъкани бързо се вграждат в съединението Tissue-Tek OCT (Sakura Finetechnical Co) и се замразяват бързо в течен азот. Откриването на супероксид се извършва, както е описано по-горе [7].

Трансмисионна електронна микроскопия

За анализ на електронна микроскопия пресните бъбречни тъкани се фиксират с ледено студен буфер, съдържащ 4% параформалдехид, 5% глутаралдехид и 0,2 М фосфатен буфер (рН 7,4). Тъканите се визуализират, както е описано по-рано [7].

Статистически анализ

Стойностите се отчитат като средни стойности ± SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ. Дисперсионният анализ (тест на Kruskal-Wallis, последван от U-тест на Mann-Whitney) е използван за статистически сравнения. За оценка на степента на преживяемост се използва анализ на Каплан-Майер. Смятахме, че разликите са значителни, когато стойността на вероятността е Фигура 1А). В допълнение, DHE оцветяването показва повишено производство на супероксид в бъбреците от HS групата (Фигура 1А). Нещо повече, имунохистохимичният анализ показа, че TfR1 и DMT-1 са силно изразени в тубулите както на HS, така и на HS + IR групите (Фигура 1А). Хепцидин-25, активната форма на регулиращия желязото хормон хепцидин, се изразява слабо в тубулите на тези групи, а хепцидин-25 положителните клетки обикновено се увеличават в групата с ХС в сравнение с останалите групи (Фигура 1А). След това оценихме съдържанието на желязо в бъбреците и екскрецията на желязо в урината в тези групи. Интересно е, че бъбречното съдържание на желязо и екскрецията на желязо с урината бяха значително увеличени в групата с HS в сравнение с другите групи (Фигура 1B, C). Нещо повече, бъбречната експресия на HO-1 гена и екскрецията на 8-OHdG с урината бяха значително увеличени в групата с HS, докато тези увеличения бяха потиснати в групата с HS + IR (Фигура 1D, E). Тези данни предполагат, че свързаното с желязо оксидативно увреждане може да бъде свързано с патофизиологията на хипертоничната нефропатия при натоварен със сол SHRSP.

натрупване

(А) Представителни изображения на берлинско синьо, DHE, TfR1, DMT-1 и хепцидин-25, оцветяване на бъбречните секции. Скала: 50 µm. (B) Бъбречно съдържание на желязо, (C) екскреция на желязо с урина, (D) бъбречна експресия на HO-1 гена и (E) екскреция на 8-OHdG в урината в контролата (бяла лента), HS (черна лента) и HS + IR (сива лента) групи (n = 4–6 във всяка група). DHE, дихидроетидий; TfR1, трансферинов рецептор 1; DMT-1, двувалентен метален транспортер 1; HO-1, хем оксигеназа-1. Контрол, SHRSP хранеше нормална диета; HS, SHRSP хранени с диета с високо съдържание на сол; HS + IR, SHRSP хранеше диета с високо съдържание на сол с ограничено желязо. * p † p Фигура 2А), показваща, че ограничаването на желязото в присъствието на HS диета инхибира увеличаването на SBP. В допълнение, диетата с HS значително повишава протеинурията, серумните нива на BUN и нивата на серумния креатинин, докато тези увеличения са отслабени в групата HS + IR (Фигура 2B-E). От друга страна, телесното тегло е намалено в групата с HS в сравнение с другите групи. Кръвният хемоглобин, средният корпускуларен обем, средният корпускуларен хемоглобин, нивата на серумно желязо и експресията на гена на хепатид в черния дроб са намалени в групата HS + IR (Таблица 1), което показва, че експресията на гена на хепатит в черния дроб е регулирана надолу в отговор на дефицита на желязо в HS + IR група. По време на експерименталния период някои плъхове умират от инсулт внезапно (33%) в групата с ХС, а някои плъхове са евтаназирани, тъй като показват припадъци, парализа на задния крайник и намалена активност (25%) в групата с ХС; обаче никой от плъховете не е умрял в групата HS + IR. Анализът на Каплан-Майер показва, че групата HS + IR има по-добра прогноза от групата HS (Фигура 2F).