Редактирано от Ajay Chawla, Калифорнийски университет, Сан Франциско, Калифорния, и прието от редакционната колегия на 12 февруари 2013 г. (получено за преглед на 11 септември 2012 г.)

насърчават

Резюме

За да тестваме възможността В-клетките да стимулират метаболитно заболяване, като подпомагат Т-клетъчно-медиираното възпаление и по този начин IR, сравнихме лимфоцитната функция, възпалението и метаболитните резултати при затлъстели WT и В-клетъчно-нулеви мишки. Данните тук показват, че В клетки от затлъстели мишки, като тези от хора с T2D, секретират провъзпалителен цитокинов профил, включително дефект в способността да произвеждат противовъзпалителни противовъзпалителни IL-10 (14). Освен това, В-клетъчно-нулевите мишки са защитени от патогенни резултати от затлъстяване и възпаление, в съответствие с нашата демонстрация, че затлъстелите В-клетъчно-мишни мишки имат повишен процент на противовъзпалителни Tregs. Тествахме значимостта на тази находка с анализи на човешки лимфоцити in vitro, които показаха, че човешките В-клетки, но не и моноцитите/макрофагите, насърчават T2D-свързано възпаление на Т-клетките чрез зависим от контакта механизъм. Взети заедно, нашите данни идентифицират функционални прилики между затлъстели/IR мишки и човешки имунни клетки и демонстрират, че В клетките увеличават възпалението при затлъстяване по два пътя: регулиране на възпалителното съотношение на Т-клетките и производство на провъзпалителен цитокинов профил.

Резултати

В клетките от затлъстели мишки отделят провъзпалителен цитокинен профил.

Предлага се, че В-клетките насърчават свързаното със затлъстяването метаболитно заболяване чрез способността им да инфилтрират разширяващия се AT и да произвеждат автоимунен продиабетогенен IgG (8, 15). Нашите проучвания подкрепят първоначално публикувания анализ на ранна В-клетъчна инфилтрация в миши епидидимален AT в отговор на диета с високо съдържание на мазнини (HFD; Фиг. S1A) (8, 15). Автоимунните IgG обаче са изключително ниски/липсват в серумите от затлъстели мишки, измерено чрез анализ на антинуклеарни антитела, клиничен показател за автоимунни антитела (Фиг. S1B). Тези данни поставят под въпрос значението на общия клас автоантитела в IR и повдигат алтернативната възможност провъзпалителните промени в В-клетъчните цитокини, съобщени в човешки T2D (2), да играят роля при лица, които нямат автоантитела, но имат IR-асоциирано възпаление.

За да тестваме възможността В-клетките от затлъстели мишки да произвеждат възпалителен цитокинов профил, който рекапитулира повишения IL-8 и драстично намалява IL-10 от В-клетките на пациентите с T2D (2), стимулирахме общите спленоцити от затлъстели или слаби мишки и след това анализирахме секреция на цитокини. Спленоцитите от затлъстяване в сравнение с постни мишки секретират по-големи количества обикновено възпалителни IL-6 и IFN-γ и по-ниски количества противовъзпалителни IL-10 в отговор на множество стимули (Фиг. 1А). Спленоцитите от затлъстели мишки също отделят по-малко IL-5 (фиг. S2A), в съответствие с демонстрацията на по-нисък процент на произвеждащи IL-5 Th2 клетки и ролята на IL-5 за подобряване на глюкозния толеранс (9, 16).

Липсата на В клетки се свързва с по-ниско системно възпаление и повишен процент на регулаторни Т клетки (Tregs) в отговор на затлъстяването. (А) Серумни цитокини при слаби и затлъстели WT и μMT мишки, както е посочено. (Б) Цитокини в супернатантите от общите спленоцити, приготвени от затлъстели WT и μMT мишки и култивирани в продължение на 40 часа или нестимулирани (среда), или стимулирани с α-CD3/α-CD28. За A и B, * μMT се различават значително от WT (P # значителна разлика между стимулирана и нестимулирана (P + CD4 + CD25 + Foxp3 + със стратегия за стробиране, показана на фиг. S6. * Разлика (P # разлика между слаби и затлъстели мишки) от същия генотип. (D) Трег анализ от слаби (бели) или затлъстели (сиви) μMT мишки от посочени тъкани. P стойностите за разликите, изчислени чрез двустранен тест на Student t са както е показано. (E) Относителна експресия на иРНК на посочени свързани с Т клетки или (F) про-/противовъзпалителни гени в епидидимална АТ от затлъстели WT (бели) или μMT (сиви) мишки. * Разлика (P + CD4 + Т клетки (т.е. добросъвестни Th17s) произвеждат IL -17 при тези условия (11). Ние заключаваме, че взаимодействието между Т клетките и В клетките и/или моноцитите задвижва T2D-асоциираната възпалителна Th17 функция при хората.

За да идентифицираме по-категорично клетките, необходими за свързаната с T2D функция Th17, стимулирахме Т клетките в присъствието на пречистени В клетки. В-клетъчно-Т-клетъчните култури рекапитулират T2D-специфичната Th17 функция, измерена чрез IL-17 (Фиг. 4B, BT), въпреки че концентрациите на IL-17 в BT кокултури са количествено по-ниски, отколкото в MBT културите. Освен това, Т-клетъчната стимулация в контекста на изчерпани В-клетки (CD19 -) PBMC показва, че премахването на В-клетки води до намаляване на свързаната с T2D функция Th17 (Фиг. 4C, CD19 -), което е приблизително производството на IL-17 от MBT култури от не-T2D проби. Паралелният анализ на мишките спленоцити показва, че изчерпването на В-клетки намалява производството на възпалителни цитокини (IL-6 и IFN-γ) в отговор на стимулация на Т-клетки (Фиг. S10), въпреки че остава възможно отстраняването на секретиращите цитокини В клетки отчасти да обясни тези промени. За разлика от това, IL-10 е намален само при изчерпване на В-клетки на спленоцити от постни мишки (фиг. S10). Този резултат е в съответствие с В клетките като значими източници на IL-10 в слаби, но не и затлъстели/IR, мишки и хора (фиг. 1В) (2).

По-ниският В-клетъчен IL-10 при затлъстяване/IR може да бъде объркан от липсата на възпалителна Т-клетъчна реакция към IL-10. За да тестваме възможността свързаните с T2D промени в Т-клетъчния IL-10 отговор да подсилват провъзпалителната функция на В-клетките, ние стимулирахме Т-клетките в контекста на изчерпани В-клетки (CD19) PBMCs и в присъствието или отсъствието на IL-10 . IL-10 значително намалява количествата на IL-17 във всички проби (фиг. 4С). Ние заключаваме, че свързано с T2D Т-клетъчно възпаление може да възникне, поне отчасти, поради намален В-клетъчен IL-10 при липса на дефектен IL-10 отговор. Взети заедно, данните от проучвания както върху хора, така и върху мишки показват, че В-клетките поддържат проинфламаторната функция на Т-клетките при IR/T2D и че свързаните със затлъстяването вътрешни промени на В-клетките, включително намаленото производство на IL-10, вероятно играят доминираща роля при свързаните с болестта Функция на Т-клетките.

Подкрепата на В-клетките на възпалителната функция Th17 при T2D (фиг. 4 А и В) не разглежда възможността моноцитите/макрофагите, първият тип имунни клетки, замесени в IR (25, 26), също да контролират възпалението на Т-клетките при затлъстяване . Следователно измерихме Th17 функцията (т.е. концентрациите на IL-17) в кокултури от пречистени моноцити и Т клетки (MT). МТ културите произвеждат подобни количества IL-17, независимо дали клетките се пречистват от не-T2D или T2D субекти (Фиг. 4D). Тези данни са в съответствие с независимото от заболяването производство на IL-17 от изчерпани В-клетки, PBMC, които позволяват MT взаимодействие (Фиг. 4C, CD19 -). Взети заедно с по-висока продукция на IL-17 в отговор на Т-клетъчна стимулация на WT в сравнение с μMT миши спленоцити (фиг. 3В) и резултати от човешки MBT и BT кокултури, данните силно подкрепят заключението, че В клетките, а не моноцитите, директно насърчават свързаната с T2D повишена провъзпалителна функция Th17. По този начин тези данни допълват демонстрацията, че В клетките регулират разширяването на Treg при затлъстяване in vivo (фиг. 3D), за да подкрепят цялостното заключение, че В клетките са главни регулатори на T2D-асоциираното Т-клетъчно възпаление.

За по-нататъшно детайлизиране на механизмите, лежащи в основата на B-медиирано Т-клетъчно възпаление при T2D, ние тествахме възможността, че контакт или, при минимално приближение, на В и Т клетки е необходим, за да могат В клетките да поддържат Т-клетъчно-медиирано възпаление. Сравнихме Th17 функцията в MTB култури с култури, които отделяха В клетките от МТ кокултури чрез цитокинопропусклива трансуелна мембрана (размер на порите 1 μm). Загубата на B-клетъчен контакт предотврати T2D-свързаното повишаване на Th17 функцията (Фиг. 4E, MT/B), което предполага, че B-клетъчните цитокини сами по себе си са недостатъчни за поддържане на възпалителната функция на T-клетките. Експерименти с блокиращо антитяло демонстрираха, че CD80/86 и CD28 не са необходими за функцията Th17, медиирана от В-клетки в T2D. Като цяло, нашите данни показват, че множество механизми, включително клетъчен контакт и намалено производство на IL-10, обясняват способността на В клетките да стимулират възпаление, медиирано от Т клетки в T2D.

Дискусия

Материали и методи

Изследвания на цели животни и непокътнати тъкани.

Всички процедури бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните в Медицинския център в Бостън. Изследванията са използвали мъжки фонови мишки C57BL/6J и стандартните протоколи са описани в SI Материали и методи.

Човешки субекти.

Съветът за институционален преглед на Медицинския център в Бостън одобри всички процедури в съответствие с Декларацията от Хелзинки и пробите бяха получени след информирано съгласие. Пациентите, които не съответстват на T2D и ИТМ, са наети от Центъра за ендокринология, диабет и хранене към Медицинския център на Бостънския университет/Бостънския медицински център. Критериите за подбор са изброени в SI материали и методи. Характеристиките на всички субекти са показани в таблица S1.

Подготовка/култура на имунни клетки.

Периферната кръв (50–100 ml) се събира в хепаринизирани епруветки чрез венозна пункция и клетките се пречистват, култивират, стимулират и събират, както е описано по-рано (2, 11). CD19 - PBMCs бяха получени чрез отстраняване на CD19 + В клетки с положително селектиране на магнитни топчета (Miltenyi) и беше потвърдено, че са изчерпани B клетки чрез анализ на потока за CD19 + клетки. Имунни клетки от мишка s.c. (ингвинални) AT се освобождават чрез ръчно дразнене на тъкан между две огънати игли, които не активират имунните клетки (посочени от CD69 повърхностно оцветяване). Целите миши спленоцити се приготвят чрез ръчно дразнене и лизис на червените кръвни клетки и след това CD19 + В клетките се пречистват чрез отрицателно селектиране на магнитни топчета (Miltenyi) и се култивират, както е описано за човешки клетки. Всички препарати за лимфоцити и моноцити са били ≥95% и ≥92% чисти, съответно, и са инкубирани при 1 милион клетки/ml. Пречистените В клетки се събират след 24 часа стимулация. Всички култури, съдържащи Т клетки, са събрани след 40 часа. Човешки IL-10 се добавя към някои култури при високи физиологични концентрации (2 ng/mL).

Биохимия.

Епидидималната AT mRNA се определя количествено, както е описано по-горе (38), като се използват праймери, специфични за CD19 (напред: 5′CCCTGTATCTCTGGCTCTGC; обратен: 5′GGGCACATACAGGCTTTGTT) с циклофилин В като контрол за нормализиране. ELISA се използва за количествено определяне на лептин, MIP-2, адипонектин и човешки IL-17. Всички допълнителни цитокини са количествено определени чрез мултиплексни анализи на протеини (Invitrogen).

Поточна цитометрия.

Кръв на мишка за анализ на потока се събира чрез сърдечна пункция и се добавя към равен обем PBS/50 mM буфер EDTA; далак и s.c. AT бяха ръчно разделени. Червените кръвни клетки бяха лизирани преди антитяло-медиираното оцветяване. Стратегиите за оцветяване са изброени в SI материали и методи. Клетките се промиват два пъти с FACS буфер (PBS с 0,5% BSA и 2 mM EDTA) след оцветяване и след това се анализират на LSR-II Flow Cytometer (BD Biosciences). За окончателен анализ на данните е използван софтуер FlowJo (версия 8.7; Tree Star). Титрирането на всеки реагент и контролите „флуоресценция минус един“ (39) бяха извършени за оптимизиране на панелите.

Благодарности

Благодарим на д-р. Jongsoon Lee и Susan Leeman за ръкописни критики; Джоел Николайчик за експертна техническа помощ; и Центъра за интердисциплинарни биомедицински изследвания на Еванс и членовете на неговото сътрудничество за изследване на афинитета за ценни дискусии и ресурси. Тази работа беше подкрепена от Национални здравни институти R21DK089270, 5R21DE021154, R56 DK090455 и R56 DK096525, Програма за обучение по имунология AI007309, Програма за обучение по хематология HL007501, Пилотна програма за изследване на ендокринологичния център за диабет в Бостън, Бостън, Изследователски център за хранене Boston N200.

Бележки под линия

↵ 1 Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.

Принос на автора: J.D., A.C.B., M.J.-B., J.S.-C., D.M., K.J.S., M.Z., R.J., M.S.O., M.E.M., C.A., G.V.D. и B.S.N. проектирани изследвания; J.D., A.C.B., M.J.-B., J.S.-C., J.D.C., D.M., K.J.S., A.A.W., M.Z., J.A., J.B., G.T., G.V.D. и B.S.N. извършени изследвания; Y.R.N., A.A.W. и M.S.O. допринесе нови реактиви/аналитични инструменти; J.D., A.C.B., M.J.-B., J.S.-C., Y.R.N., G.T., R.J., G.V.D. и B.S.N. анализирани данни; и J.D., J.S.-C., M.S.O., M.E.M., C.A., G.V.D. и B.S.N. написа вестника.

Авторите не декларират конфликт на интереси.