Резюме

Ванилинът, просто фенолно съединение, съществува незначително в някои растения и може да бъде произведен от микроби. Това проучване използва затлъстели мишки с високо съдържание на мазнини (HFD), за да проучи ефекта на ванилина върху затлъстяването и да получи положителни резултати. Първо, теглото както на тялото, така и на мастната тъкан се намалява. Второ, свойствата на кръвта, сигнализиращи за определени нарушения като ALT, LDH, глюкоза, холестерол, LDL-C, TG и HDL-C, се подобряват и се подобряват както инсулиновата чувствителност, така и глюкозният толеранс. Трето, ванилинът намалява повишените нива на възпалителни фактори, включително LPS, IL-6 и TNF-α в плазмата и чернодробната тъкан в резултат на затлъстяване. И накрая, производството на късоверижни мастни киселини (SCFA) се подобрява. Освен това резултатите от проучването показват, че ванилинът значително облекчава свързаните със затлъстяването нарушения на чревната микробиота (ГМ), включително намаляването на алфа- и бета-разнообразието. Освен това ванилинът намалява изобилието на Firmicutes phylum, увеличава богатството на Bacteroidetes и Verrucomicrobiota phyla и инхибира разширяването на липополизахаридните (LPS) продуциращи бактерии род Bilophila и H2S-продуциращите бактерии Desulfovibrio род.

Въведение

Експериментално

Химикали

Всички ванилин и други химически реагенти са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ), освен ако не е посочено друго.

Методи

Животни и диети

Мъжки мишки C57BL/6J, закупени на 21-дневна възраст (Vital River Laboratory Animal Technology. Co. Ltd., Китай), бяха настанени индивидуално в стандартни условия (12/12 h светло-тъмен цикъл, влажност при 50 ± 15%, температура 22 ± 2 ° C) и се хранят със стандартна лабораторна храна за 1 седмица. След 7-дневен период на адаптация, мишките бяха разпределени на случаен принцип в три групи (n = 7–8), включително (1) CHOW група, хранена със стандартна диета с гризачи за гризачи (3,85 kcal/g, 10% енергия от мазнини), (2) HFD група, хранена с HFD диета (4,73 kcal/g, 60% енергия от мазнини) и (3) Va група, хранена с HFD диета (4,7 kcal/g, 60% енергия от мазнини, съдържаща 0,1% ванилин, m/m) . Дозировката на ванилин е посочена в изследванията на Liao, които са използвали кофеинова киселина за лечение на затлъстяване (Liao et al., 2013).

Храната (Huangfukang, Китай), използвана в това проучване, е стерилизирана с помощта на лъчение (25,0 kGy). Храната и водата се предоставят ad libitum и храната се записва на всеки 3 дни. Телесното тегло се записва седмично. След 14-седмичен експериментален период мишките гладуват 12 часа и плазмата се събира чрез екстирпация на очната ябълка. Съдържанието на дебелото черво, ректума и цекума се събира, обединява и съхранява при -80 ° C за допълнителен анализ. Измерва се теглото на черния дроб, ингвиналната бяла мастна тъкан (iWAT) и епидидималната бяла мастна тъкан (eWAT). Тъканите бяха запазени под -80 ° C за генна експресия и черният дроб беше използван за оцветяване с масло Red-O.

Бяха спазени насоките на Института относно грижите и използването на лабораторни животни. Това проучване беше одобрено от Комитета за експерименти с животни към Колежа по хранителни науки и хранително инженерство към Китайския земеделски университет.

Тестове за толерантност към глюкоза и инсулин (GTT и ITT)

GTT беше извършен на 12-седмични мишки (след 9-седмични мишки от HFD и Va групите, променени на HFD) след 16 часа бързо. Концентрациите на глюкоза са измерени в кръв, събрана от венозно кървене от вената на опашката преди и 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути след интраперитонеална инжекция от 1,5 g/kg глюкоза в телесно тегло, с помощта на глюкометър Roche Diabetes Care (Roche, Германия). ITT беше проведен на 13-седмични мишки след 6 часа гладуване. Концентрациите на глюкоза са измерени в кръвта, събрана от венозно кървене преди и 15, 30, 45 и 60 минути след инжектирането на инсулин (Novolin, 30 R, 1,0 U/kg телесно тегло).

Ядрено-магнитен резонанс (ЯМР)

Ядрено-магнитен резонанс е извършен след 11 седмично лечение в Института по лабораторни науки за животните, CAMS & PUMC, Китай. Мишките се анестезират с 2% изофлуран преди и по време на експеримента. ЯМР изображенията бяха анализирани с помощта на софтуера Argus.

Количествен анализ на PCR в реално време (qPCR)

Общата РНК се извлича с помощта на TRIzol TM Regent (Invitrogen) съгласно инструкциите на производителя. Обратната транскрипция на общата РНК (2.5 μg) беше извършена с комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Promega Biotech Co., Ltd). Реакциите qPCR се провеждат в два екземпляра за всяка проба и се анализират в PCR система в реално време LightCycler 480 (Roche). Данните бяха нормализирани към актина за вътрешен контрол и анализирани с помощта на ΔΔCT метода (Aguilera et al., 2009). Експресията на гени на възпалителен фактор, включително фактор на туморна некроза (TNF-α) и интерлевкин 6 (IL-6) в черния дроб и адипоцитната тъкан, както и бактериалното натоварване се определят чрез qPCR (използваните праймери са показани в таблица Таблица 1 1 ).

маса 1

Количествени PCR праймери, използвани в това проучване.

GeneForwardReverse
IL-65′-AGACAAAG CCAGAGTCCTTCAG5 ′ -GCCACTCC TTCTGTGACTCCAG
TNF-α5′-CCAACAAG GAGAAGT5′-GTATGAAGT GGCAAATCG
16-те универсални5′-ACTGGGTA TAAAGNG5′-TACCAGGG TCTCTAATCC
16s рРНК (V3-V4)5′-AATGATAC GGCGACCACCGAG ATCTACACTATGG TAATTGTGTGCCA GCMGCCGCGGTAA5 ′ -CAAGCAGA AGACGGCATAC GAGATXXXXXX XXXXXXAGTCAGTC AGCCGGACTACHVG GGTWTCTAAT

За количествено определяне на бактериалното натоварване, общата бактериална ДНК се изолира от претеглените обединени проби, използвайки QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen). След това ДНК беше подложена на qPCR, използвайки QuantiFast SYBR Green PCR комплект (Biorad) с универсални 16SrRNA праймери (Таблица (Таблица 1) 1) (Cho et al., 2012). Резултатите са изразени като брой бактерии на g проби, като се използва стандартна крива, която е изградена с помощта на Bifidobacterium longum.

Маслено червено-оцветяване

Оцветяването с масло Red-O се извършва, както е описано от Ross et al. (1999). Накратко, резените на черния дроб се измиват с буфериран с фосфат физиологичен разтвор, фиксират се в 3,7% формалдехид за 2 минути, измиват се с H2O, инкубират се с разтвор на Red Red-O за 1 h при стайна температура и след това се измиват с H2O.

Параметри на плазмата

Плазмените биохимични параметри, включително аланин трансаминаза (ALT), глюкоза, холестерол, триглицериди (TG), липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-C), липопротеинов холестерол с ниска плътност (LDL-C) и лактат дехидрогеназа (LDH) са определена от 3100 клиничен анализатор (Hitachi High-Technologies Corporation, Япония). Факторите на плазменото възпаление, включително IL-6, TNF-α и LPS, се определят чрез комплекти за имуносорбентен анализ (ELISA) (ThermoFisher, САЩ), в съответствие с инструкциите за експлоатация.

Определяне на концентрацията на SCFA

ГМ анализ

Общата геномна ДНК беше извлечена от обединените проби, използвайки метода CTAB/SDS. Концентрацията и чистотата на ДНК се проследяват върху 1% агарозни гелове и се разреждат до 1 ng/μl, като се използва стерилна вода. 16S рРНК гени се амплифицират, използвайки специфичния праймер (Таблица (Таблица 1) 1) с баркод. Всички PCR реакции се провеждат в 30 μL разтвори с 15 μL Phusion ® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, САЩ), заедно с 0,2 μM правни и обратни праймери, и около 10 ng матрична ДНК. Термичното циклиране се състои от първоначална денатурация при 98 ° C в продължение на 1 минута, последвана от 30 цикъла на денатурация при 98 ° C за 10 s, отгряване при 50 ° C за 30 s и удължаване при 72 ° C за 30 s и накрая, 72 ° С за 5 минути. PCR продуктите се смесват на равни части. Сместа се пречиства, като се използва GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, САЩ). Библиотеките за секвениране бяха генерирани с помощта на TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit, следвайки препоръките на производителя. Добавени са индексни кодове. Качеството на библиотеката беше оценено на флуорометър Qubit @ 2.0 (Thermo Scientific) и системата Agilent Bioanalyzer 2100. И накрая, библиотеката беше секвенирана на Illumina HiSeq 2500 и бяха генерирани 250 bp сдвоени четения.

Четенията на сдвоени краища от оригиналните фрагменти на ДНК бяха обединени с помощта на FLASH, (Magoč и Salzberg, 2011), високоскоростен и точен инструмент за анализ, предназначен за обединяване на четения на сдвоени краища, когато има припокривания между четене 1 и четене 2. четенията бяха присвоени на всяка проба според уникалните баркодове. Последователностите бяха анализирани с помощта на софтуерния пакет QIIME (Caporaso et al., 2010) (Quantitative Insights Into Microbial Ecology). Вътрешните скриптове на Perl бяха използвани за анализ на алфа- (в рамките на проби) и бета- (сред пробите) разнообразие. Първо, четенията бяха филтрирани от филтри за качество на QIIME. След това pick_de_novo_otus.py се използва за избор на оперативни таксономични единици (OTU) чрез създаване на OTU таблица. Поредици с ≥97% сходство бяха присвоени на едни и същи OTU. Изследователите избраха представителна последователност за всяка OTU и използваха класификатора RDP (Wang et al., 2007), за да анотират таксономична информация за всяка представителна последователност.

Статистика

Всички данни, съобщени в тази статия, са изразени като средни стойности ± SD. Данните бяха оценени чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста за значителна разлика на Дънкан. Всички статистически данни бяха анализирани от софтуера SPSS и извършени с GraphPad Prism 7.

Резултати

Ванилинът облекчава метаболитните синдроми, причинени от HFD

Ванилин облекчава затлъстяването, предизвикано от HFD

облекчава

Ванилинът облекчава глюкозната непоносимост и IR на мишките, свързани със затлъстяването. (A, C) Промените в концентрациите на глюкоза в кръвта по време на GTT (А) и ITT (° С). ∗ P # P ∗∗ P ∗∗∗∗ P Фигури 2G 2G - показвам, че в сравнение с мишките в групата CHOW, плазмената концентрация на LPS, TNF-α и IL-6 в групата на HFD е значително увеличена. Едновременно с това тези параметри бяха значително повишени при мишки от Va група, в сравнение с тези в групата с HFD. В съответствие с тези резултати, експресиите на TNF-α и IL-6 в дебелото черво и черния дроб са значително по-високи в групата с HFD, отколкото в групите Va и CHOW (Фигури 2J, K).

Ванилинът засилва производството на SCFA

Чревните SCFA се произвеждат чрез анаеробна ферментация на полизахариди и са от решаващо значение за здравето на червата. В сравнение с групата на HFD, Фигура 4 показва, че ванилинът значително увеличава концентрациите на ацетат, пропионат и бутират, по-рано намалени от HFD. Обратно, n-валериановата киселина не е била значително повлияна от диетата.

Концентрацията на SCFAs в цекалното съдържание. АА, ацетатна киселина; PA, пропионатна киселина; BA, бутиратна киселина и VA, валерианова киселина. ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P ∗∗∗∗ P Фигура 5C 5C показва, че броят на откритите видове първоначално се разширява, но се забавя с увеличаването на дълбочината на секвенирането. Той остава предимно непроменен, когато дълбочината достигне определено ниво. Тези резултати предполагат, че дълбочината на последователността е достатъчна за последващ анализ. Изобилието на Firmicutes phylum в HFD мишки с ГМ състав е значително по-високо (P = 0,02 както за CHOW, така и за Va групи), отколкото това при CHOW и Va групите (Фигури 5А, B). Факултативните анаеробни бактерии като Proteobacteria phylum са по-високи в групата на HFD в сравнение с тази на групите CHOW (P = 0,07) и Va (P = 0,29). Филмът Verrucomicrobia от групата на HFD обаче е недостатъчно представен в сравнение с CHOW (P 5E, I). Други параметри, отразяващи богатството на ГМ, включително индекса на асо и наблюдаваните видове, показват подобни резултати (Фигури 5D, F). В допълнение към богатството, хомогенността на ГМ не се различава значително между групите, както е показано в индексите от Шанън и Симпсън (Фигури 5G, H).

Ванилинът частично възстановява ГМ до нормалното му състояние. (A, B) Анализ на основни компоненти (PCA) на ГМ при филум (А) и ИЗВЪН (Б) нива, съответно. (° С) Основен координатен анализ (PCoA) на GM, базиран на претеглено разстояние UniFrac. (Д) Общи OTU междугрупи. (E, F) Анализ на биомаркер (LEfSe) между HFD и CHOW (E) и Ва (F), съответно. Праговата стойност на LDA е три.

Дискусия

Въпреки връзката между подобрената ГМ и резистентното затлъстяване, лекувано с ванилин, механизмът, задвижващ тази връзка, остава неясен. Например, подобряването на ГМ причина ли е или резултат от устойчиво затлъстяване, подложено на ванилин? Освен това, ако това е резултат, какъв е механизмът? Следователно са необходими повече изследвания, за да се дадат отговори на тези въпроси.

Принос на автора

Всички изброени автори са направили съществен, пряк и интелектуален принос в работата и са я одобрили за публикуване.

Изявление за конфликт на интереси

Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на каквито и да било търговски или финансови отношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси.

Бележки под линия

Финансиране. Тази работа беше подкрепена от Националната ключова програма за изследвания и развитие на Китай (2017YFD0401202) и Националната ключова програма за научноизследователска и развойна дейност на Китай (2016YFD0400500).