Отдел за фармацевтични и биомедицински науки, Фармацевтичен колеж, Университет на Джорджия, Атина, Джорджия, Съединени американски щати

диетично

Отдел за фармацевтични и биомедицински науки, Фармацевтичен колеж, Университет на Джорджия, Атина, Джорджия, Съединени американски щати

Отдел за фармацевтични и биомедицински науки, Фармацевтичен колеж, Университет на Джорджия, Атина, Джорджия, Съединени американски щати

  • Мингминг Гао,
  • Йонджи Ма,
  • Декси Лиу

Фигури

Резюме

Цитат: Gao M, Ma Y, Liu D (2015) Затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, възпаление на мастната тъкан, чернодробна стеатоза и хиперинсулинемия при мишки с безплодни CD-1. PLoS ONE 10 (3): e0119784. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119784

Академичен редактор: Krisztian Stadler, Pennington Biomedical Research Center, САЩ

Получено: 28 юни 2014 г .; Прието: 17 януари 2015 г .; Публикувано: 13 март 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Изследването беше подкрепено отчасти от безвъзмездни средства от NIH (RO1EB007357 и RO1HL098295). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Разпространението на затлъстяването (индекс на телесна маса> 30 kg/m 2), до голяма степен обусловено от глобалните промени в диетата и начина на живот, достига епидемично ниво в световен мащаб [1,2]. Епидемиологичните проучвания доказват, че честотата на затлъстяването се променя между региони и раси, като в Близкия изток, Централна и Източна Европа и Северна Америка се наблюдава по-голямо разпространение [1]. В допълнение към регионалните разлики, затлъстяването показва и полова разлика, като жените имат по-голямо разпространение от мъжете [1,3]. Неравенството между половете при затлъстяването се засилва допълнително сред жените в развиващите се страни, особено в Близкия изток и Северна Африка [4]. Затлъстяването влияе негативно на човешкото здраве по много начини и ефективното управление на тази епидемия изисква по-добро разбиране на нейната патогенеза [5].

За да отразим факта, че жените съставляват голяма част от затлъстелата популация, в това проучване ние характеризирахме индуцирани от HFD метаболитни промени по зависим от времето начин, използвайки женски мишки CD-1. Демонстрираме, че HFD прогресивно индуцира различни метаболитни нарушения, включително затлъстяване, хипертрофия на адипоцитите, отлагане на ектопична мазнина, инсулинова резистентност, хиперинсулинмия и хипертрофия на панкреатичните островчета, което е свързано с повишена експресия на гени, участващи в хронично мастно възпаление и чернодробна липидна секвестрация.

Материали и методи

Животни

Женски мишки CD-1 (~ 22 g) са закупени от Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Шестседмични мишки бяха настанени (5 на клетка) в централно контролирано животно съоръжение за въздух, влажност и температура (22 ° C). Процедурите, приложени върху тези животни, са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните към Университета на Джорджия (Номер на протокола, A2011 07-Y2-A3). Тези мишки бяха разделени на случаен принцип в 2 групи и хранени или с обикновена чау, или с HFD (60% kcal от мазнини, 20% от въглехидрати и 20% от протеини), закупени от Bio-Serv (Frenchtown, NJ; # F3282). Телесното тегло и приема на храна се измерват ежеседмично. Съставът на тялото се определя ежемесечно с помощта на EchoMRI-100 (Echo Medical Systems, Хюстън, Тексас).

Глюкозен толеранс и тест за инсулинова толерантност

Проведен е интраперитонеален тест за глюкозен толеранс (IPGTT) на мишки, хранени с HFD в продължение на 10 седмици. Мишките бяха на гладно 6 часа преди теста. Животните се инжектират (8 ml/kg, i.p.) с глюкоза, разтворена във физиологичен разтвор (2 g/kg), и глюкозата в кръвта се измерва на 0, 30, 60 и 120 минути с помощта на глюкозни тест ленти и глюкомери. 1 седмица след IPGTT е извършен интраперитонеален тест за толерантност към инсулин. Мишките се гладуват в продължение на 4 часа и се инжектират (8 ml/kg, i.p.) с инсулин (Humulin, 0.75 IU/kg), закупен от Eli Lilly (Indianapolis, IN). След това се определят нивата на кръвната глюкоза на 0, 30, 60 и 120 минути.

Определяне на химията на кръвта

Кръвните проби бяха събрани и центрофугирани при 4000 rpm за 5 минути, за да се изолира серум. Триглицеридите в кръвта бяха измерени с помощта на търговски комплект (# TR22203), закупен от Thermo-Scientific (Middletown, VA). Нивото на свободните мастни киселини в серума се определя с помощта на комплект (# EFFA-100), закупен от BioAssay Systems (Hayward, Калифорния). Циркулиращият TNFa се определя с помощта на комплект ELISA (# 88-7324-86) от eBioscience (Сан Диего, Калифорния). Нивата на инсулин се определят с помощта на комплект ELISA (# 10-1113-01), закупен от Mercodia Developing Diagnostics (Winston Salem, NC). Кръвните концентрации на аспартат аминотрансфераза (AST) и аланин аминотрансфераза (ALT) са измервани с търговски комплекти (# TR70121, # TR18503), закупени от Thermo-Scientific.

Липопротеинова електрофореза

Плазмените проби бяха инкубирани с Nile Red (# N3013, Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО) при 37 ° С в продължение на 30 минути и разделени с помощта на агарозен гел. Електрофорезата в агарозен гел се провежда чрез използване на 0,75% агароза в барбитален буфер (рН 8,6; йонна сила 0,075) при стайна температура. Изображението е документирано с помощта на Gel Doc EZ система (# 170-8270), закупена от Bio-Rad (Херкулес, Калифорния).

Чернодробно определяне на триглицеридите

Чернодробните проби бяха прясно нарязани при ~ 200 mg на парче и съхранявани при -80 ° C до употреба. Тъканите се хомогенизират при стайна температура, като се използва разтвор, състоящ се от хлороформ и метанол (2: 1, обемно съотношение). Хомогенатите се инкубират при 4 ° С за една нощ и се центрофугират при 12 000 rpm в продължение на 20 минути. Супернатантите се прехвърлят в нови епруветки, изсушават се и се разтварят напълно в 5% Triton-X100. Концентрацията на триглицеридите се определя чрез използване на търговски комплект (# TR22203, Thermo-Scientific).

Анализ на генната експресия

Общата мРНК от черния дроб се приготвя, като се използва реагентът TRIZOL (# 15596-018), закупен от Invitrogen (Grand Island, NY). Мастната иРНК беше изолирана с помощта на комплект RNeasy (# 74804), закупен от QIAGEN (Валенсия, Калифорния). Проведена е полимерна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR), като се използва комплект за синтезиране на cDNA на верига (# NP100042), закупен от OriGene Technologies (Rockville, MD). Количествената PCR в реално време (qPCR) беше извършена, използвайки SYBR Green като реагент за откриване на PCI системата в реално време на ABI StepOnePlus. Данните бяха анализирани с помощта на ΔΔCt метода чрез нормализиране към вътрешния контрол на GAPDH иРНК. Праймерите са синтезирани в Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури) и техните последователности са изброени в S1 Таблица. Анализът на кривата на топене на всички продукти на qPCR беше проведен и показа единичен ДНК дуплекс.

Хистологични изследвания

Проби от ингвинална бяла мастна тъкан (WAT), кафява мастна тъкан (BAT), черен дроб и панкреас бяха събрани и незабавно фиксирани с 4% неутрален буфериран формалин в продължение на 3 дни. Тъканите бяха дехидратирани и вградени в парафин. Разрез на тъкан се изрязва на 6 μm за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E), използвайки търговски комплект (# 3500), закупен от BBC Biochemical (Atlanta, GA). Слайдовете бяха изследвани с помощта на оптичен микроскоп (ECLIPSE Ti). Размерът на адипоцитите е количествено определен по предварително докладван метод с незначителни модификации [13]. Накратко, разрезът на мастната тъкан беше разгледан при 20-кратно увеличение. Четири слайда от всяка група бяха включени в количественото определяне и 5 полета бяха избрани произволно на всеки слайд. За всяко поле бяха избрани на случаен принцип 10 адипоцити и количествено определени с помощта на образната платформа за изображения NIS-Elements, закупена от Nikon Instruments Inc. (Melville, NY). За замразеното сечение и оцветяването с маслено червено О, чернодробните проби незабавно се замразяват с помощта на течен азот и се съхраняват при -80 ° C до употреба. Чернодробните секции бяха нарязани на 8 μm с помощта на криостат. Оцветяването с маслено червено О се извършва с помощта на реагенти, закупени от Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA).

Статистика

Данните бяха изразени като средна стойност ± SD. Статистическият анализ беше извършен с помощта на t-теста на Student и Р стойност под 0,05 (P Фиг. 1. HFD повишено повишаване на телесното тегло при женски CD-1 мишки.

(А) Крива на растеж на мишки на HFD или чау. (Б) Представителни изображения на мишки (дължина на лентата = 1 см). (C) Прием на енергия. Стойностите в (A) и (C) представляват средна стойност ± SD (n = 10). * P Фиг. 2. HFD причинява хипертрофия на белите адипоцити.

(A) Чиста маса (n = 10). (B) Маслена маса (n = 10). (C) Представителни изображения на хистологични изследвания по WAT (дължина на лентата = 100 μm). (D) Диаметър на адипоцитите (n = 4). Стойностите в (A), (B) и (D) представляват средна стойност ± SD. ** P Фиг. 3. Анализ на генната експресия в WAT.

(A) Ниво на изразяване на F4/80. (B) Ниво на изразяване на Cd11b. (C) Ниво на изразяване на Cd11c. (D) Ниво на изразяване на Mcp-1. (E) Ниво на изразяване на Tnf-α. (F) Ниво на експресия на лептин. Стойностите представляват средна стойност ± SD (n = 4). ** P 4 μm 2 е значително намален с ∼57% в края на експеримента (Фигура 4В). Нито кръвните триглицеридни, нито липопротеиновите профили са били значително променени при HFD хранене (Фиг. 4C-D). Не е установена значителна разлика в свободните мастни киселини в кръвта между мишките с HFD и тези на редовно чау (S2 Фиг.). Като цяло, този набор от резултати доказва, че HFD предизвиква избелване на НДНТ, без да променя значително кръвните концентрации на триглицериди и свободни мастни киселини.

(А) Представителни изображения на хистологични изследвания на НДНТ. (Б) Измерване на ядра на НДНТ. (C) Определяне на кръвен триглицерид. (D) Представителен образ на липопротеиновата електрофореза (C за чау и H за HFD). Стойностите в (B) и (C) представляват средна стойност ± SD (n = 4). ** P Фиг. 5. HFD-индуцирана чернодробна стеатоза.

(А) Представителни изображения на чернодробни хистологични изследвания. (Б) Определяне на чернодробните триглицериди. (C) Кръвна аспартат аминотрансфераза. (D) Аланин аминотрансфераза в кръвта. Стойностите в (B), (C) и (D) представляват средна стойност ± SD (n = 4). ** P Фиг. 6. Експресия на гена в черния дроб.

(A) Ниво на експресия на Ppar-γ2. (B) Ниво на изразяване на Cd36. (C) Ниво на изразяване на Mgat1. (D) Ниво на изразяване на Fgf21. Стойностите представляват средна стойност ± SD (n = 4). * P Фиг. 7. HFD нарушена глюкозна хомеостаза, която впоследствие доведе до хиперинсулинемия и хипертрофия на панкреатичните островчета.

В заключение, в това проучване ние демонстрираме, че безпородните женски CD-1 мишки показват прогресивно повишено затлъстяване, експресия на мастна възпалителна генна функция, натрупване на чернодробна мазнина и хиперинсулинема, когато са предизвикани с HFD. Тези резултати колективно предполагат, че женската CD-1 мишка е в състояние да служи като животински модел за физиологично, патологично и фармакологично изследване на метаболитни нарушения, предизвикани от диета при мишки. Тъй като безпородните мишки представляват хетерогенната човешка популация, настоящото проучване предоставя директни доказателства в подкрепа на използването на CD-1 мишки, които са много по-евтини от други популярни самородни мишки, като по-добър животински модел за изследване на затлъстяването и свързаните със затлъстяването метаболитни нарушения.