Резюме

Заден план

Широко известно е, че солта е ускоряващ фактор за прогресирането на метаболитния синдром и причинява сърдечно-съдови заболявания, най-вероятно поради своите прооксидантни свойства. Ние предположихме, че прекомерният прием на сол също улеснява развитието на неалкохолен стеатохепатит (NASH), който често се свързва с метаболитен синдром.

Методи

Ние изследвахме обострящия ефект на диетата с високо съдържание на сол върху индуцираното от диета увреждане на черния дроб при податлив модел на оксидативен стрес, апоЕ нокаут и трансгенни мишки с подобна на лектин окислена липопротеинова липопротеинова рецепция-1 (LOX-1).

Резултати

Диетата с високо съдържание на сол доведе до NASH при диетични LOX-1 трансгенни/апоЕ нокаутиращи мишки с високо съдържание на мазнини, без да се влияе от дислипидемия с високо съдържание на мазнини или натрупване на чернодробни триглицериди. Освен това диета с високо съдържание на сол и мазнини стимулира производството на оксидативен стрес и възпалителната реакция в по-голяма степен, отколкото диетата с високо съдържание на мазнини в черния дроб на LOX-1 трансгенни/апоЕ нокаутиращи мишки.

Заключения

Демонстрирахме, че диетата с високо съдържание на сол обостря NASH при трансгенни/нокаут мишки LOX-1, хранени с високо съдържание на мазнини, и че този ефект е свързан със стимулирането на окислителните и възпалителни процеси; това е първото проучване, което предполага важната роля на прекомерния прием на сол в развитието на NASH.

Заден план

Безалкохолният стеатохепатит (NASH) привлича вниманието напоследък поради нарастващото му разпространение и тесни връзки с хронични заболявания, като диабет, дислипидемия и затлъстяване, които са основните компоненти на метаболитния синдром (MetS) [1] - [6] В допълнение, няколко скорошни проучвания съобщават, че съществува и тясна връзка между NASH и хипертонията [7] - [9]. Следователно, NASH се счита за чернодробна проява на MetS. Важното е, че процентът на преживяемост е намален при пациенти с NASH, които често умират от причини, свързани с черния дроб, в допълнение към сърдечно-съдови събития [10]. Тъй като NASH не е доброкачествено заболяване, той се счита за важен за здравето компонент на MetS [11], [12].

В началото и прогресирането на NASH, холестеролът играе основна роля в развитието на NASH, причинявайки оксидативен стрес в чернодробната тъкан [13]. Диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) увеличава свободните мастни киселини, които индуцират митохондриално β окисляване и свръхпроизводството на свободни радикали [13], като и двете играят важна роля в развитието на NASH. По принцип пациентите с NASH са склонни да консумират прекомерно наситени храни, обогатени с мастни киселини и холестерол, без да доставят антиоксидативни хранителни вещества, като витамини Е и С; чувствителността към оксидативен стрес и прекомерният прием на липиди могат да бъдат характеристики на пациентите с NASH [8]. Като се има предвид експерименталният факт, че витамин Е и С подобряват увреждането на черния дроб в NASH [14], [15], стимулиращите околната среда и присъщи реактивни кислородни видове (ROS) стимулиращи стимули ускоряват появата и прогресията на NASH.

Наскоро няколко проучвания предполагат, че прекомерният прием на сол би стимулирал производството на ROS в различни органи, включително кръвоносни съдове [16], бъбреци [17], сърце [18] и мозък [19], в модел, използващ плъхове, чувствителни към сол на Dahl. В допълнение, диетата с високо съдържание на сол (HSD) също показва повишаване на оксидативния стрес в бъбреците [20] и артериоларните и венуларните стени в скелетните мускули при нормални плъхове [21]. Следователно, ние предположихме, че прекомерният прием на сол, индуктор на оксидативен стрес, е ускорител на появата и прогресията на HFD-индуциран NASH поради свръхпроизводството на ROS.

За да изясним нашата хипотеза, използвахме HFD хранени лектиноподобни окислени липопротеинови рецептори-1 (LOX-1) трансгенни (Tg) и апоЕ нокаут (KO) (TgKO) мишки като модел на MetS [22], който следва хроничен курс. Тъй като LOX-1, рецептор за окислен липопротеин с ниска плътност (ox-LDL), който се натрупва в атеросклеротичната васкулатура, се препоръчва да причини увреждане на клетките, свързано с оксидативен стрес [23], [24], се очаква LOX- 1 свръхекспресията може допълнително да увеличи увреждането на органите от индуцирана от сол свръхпродукция на ROS и да причини прогресията на NASH. В това проучване ние изследвахме ефекта от диетата с високо съдържание на сол и мазнини (HS/HFD) и HFD върху увреждането на черния дроб при мишки TgKO. Освен това изследвахме дали антиоксидантът 4-хидрокси-2, 2, 6, 6-тетраметил-пиперидин-н-оксил (темпол) може да подобри увреждането на черния дроб при мишки TgKO.

Материали и методи

Поколение на LOX-1 Tg/apoE KO (TgKO) мишки

Целевата експресия на гена LOX-1 в ендотелните клетки се генерира, както е описано по-горе [25]. Хетерозиготни линии LOX-1 Tg мишки, носещи 24 копия на трансгена, бяха кръстосани с хомозиготни C57BL/6: апоЕ KO мишки за генериране на TgKO бяха разработени, както е описано по-горе [26] и обратно кръстосани осем пъти с щам C57BL/6, за да заменят генетичния фон . Хомозиготната мутация в апоЕ гена е потвърдена чрез анализ на Southern blot, както е описано по-рано [27].

Животни и протоколи

Настоящото проучване е проведено при 8-седмични мъжки мишки TgKO. Те бяха разпределени на случаен принцип в групи, хранени с нормална диета (ND) (0,5% тегловна сол и 13% мазнини за калории), HFD (38% мазнини) или HS/HFD (7,9% HFD, съдържаща сол) в продължение на 8 седмици. Някои от мишките TgKO, хранени с HS/HFD, бяха третирани с антиоксидант темпол (Sigma-Aldrich, Mo) (7 mmol/L в питейна вода за 8 седмици).

Всички животни са получили хуманни грижи в съответствие с критериите на Националния изследователски съвет, очертани в „Ръководство за грижа и използване на лабораторни животни“, изготвено от Националната академия на науките на САЩ и публикувано от Националните здравни институти на САЩ. Протоколът е одобрен от Комитета по етика за изследване на животните към университета в Токио (номер на разрешение: P08-051). Всички операции бяха извършени под анестезия на натриев пентобарбитал и бяха положени всички усилия за минимизиране на страданието.

Чернодробна хистология

За хистология от центъра на всеки чернодробен лоб бяха приготвени парафинови участъци от чернодробна тъкан с дебелина 5 μm. Впоследствие срезовете бяха оцветени с хематоксилин и еозин, трихром на Masson’s или антитела срещу 4-хидроксиноненал (4HNE) и F4/80, TNF-α, супероксид дисмутаза-1 (SOD-1), каталаза, глутатион. Тежестта на заболяването на NASH се оценява според системата за класифициране/етапиране на Brunt et al. [28] и оценка на активността на неалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) на Kleiner et al. [29].

За изследване на производството на ROS, имунохистохимия на 4HNE (анти-4HNE антитяло; JaICA, Shizuoka, Япония) и SOD-1 (анти-SOD-1; sc-11407, Санта Круз, Калифорния), каталаза (антикаталаза; sc-50508, Санта Круз, Калифорния), бяха извършени глутатион (анти-глутатион; AB-T01, Разширени системи за насочване, Калифорния). За откриване на възпаление чернодробните секции бяха оцветени за F4/80 (анти-F4/80; sc-59171, Санта Круз, Калифорния) и TNF-α (анти-TNF-a; ab-34674, Abcam, Cambridge, Великобритания).

Хистологичните характеристики на черния дроб са оценени от двама изследователи, които не са знаели за произхода на предметите. Резултатът за активност на NAFLD се оценява на 5 двойно заслепени произволни изображения на животно (n = 6–23) от различни лобове на черния дроб.

Измерване на биохимичния индекс

Нивото на общия холестерол в серума е измерено след 8 седмици диета с помощта на комплекти ELISA (T-Cho H, Wako, Osaka, Japan). Активността на серумна аланин трансаминаза (ALT) беше измерена спектрофотометрично, като се използва търговски наличен комплект за тестване (ALT реагенти, Alfresa, Осака, Япония). Общо чернодробните триглицериди се екстрахират от лиофилизирани проби чрез хлороформ: метанол (2: 1). Триглицеридите в екстракта от чернодробна тъкан впоследствие се определят ензимно в автоанализатор, използвайки търговски комплект (триглицериди тип L от Wako H, Wako, Осака, Япония). Като кръвен маркер за чернодробна фиброза, серумна хиалуронова киселина (HA) също беше изследвана с помощта на търговски комплект (Lpia ace HA, IATRON, Токио, Япония).

Western blot анализ

Уестърн блотинг се извършва, както е описано по-горе [30]. 4HNE, фибронектин и бета-актин се попиват върху същата мембрана със съответните моноклонални антитела. Първичните антитела са 4HNE (JaICA, Shizuoka, Япония), фибронектин (sc-71113, Санта Круз, Калифорния) и β-актин (A-5316, Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО). Петната са количествено определени чрез анализ на изображението на Scion.

Анализ на нивата на иРНК на ендогенен и трансгенен LOX-1

Общата РНК беше извлечена от чернодробните тъкани. За анализ на верижна реакция на полимеразна обратна транскрипция (RT-PCR) продуктът на cDNA се синтезира и амплифицира чрез PCR, използвайки търговски комплект (Thermoscript RT-PCR kit, Invitrogen, CA). Условията на термичен циклер бяха 35 цикъла от 94 ° C за 40 секунди, 60 ° C за 1 минута и 72 ° C за 1 минута за LOX-1.

Измерване на предизвиканото от никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) производство на супероксид в черния дроб

Производството на супероксидни аниони в черния дроб се измерва, като се използва хемилуминесценция на луцигенин в микропланшетен луминометър (LB 9507, Berthold Technologies, Германия), както е описано по-рано [18].

Чернодробни перфузионни експерименти

Мишките се анестезират с пентобарбитал (50 mg/kg) и катетърът се въвежда в порталната вена. Черният дроб се перфузира с бикарбонатен буфер на Krebs-Henseleit, наситен с 95% O2 и 5% CO2 при 5 ml/min за 5 минути при 37 ° C. Впоследствие черните дробове се перфузират с бикарбонатен буфер на Krebs-Henseleit, съдържащ 1 mM H2O2 в продължение на 10 минути, и бикарбонатен буфер на Krebs-Henseleit, съдържащ 0,05% нитро син тетразолий (NBT, Sigma-Aldrich, Mo) за 5 минути. След това черният дроб беше фиксиран от 10% формалин, вграден в парафин, разделен и оцветен с бързо ядрено червено. Степента на отлагания на формазан е оценена чрез светлинна микроскопия [31].

Статистически анализ

Всички стойности са изразени като средна стойност ± SEM. Сравненията между групите бяха изчислени чрез ANOVA, последвано от метода на Дънет и вероятностни стойности на P

Резултати

RT-PCR анализ на експресията на LOX-1 в черния дроб

Ние потвърдихме само експресията на LOX-1 трансгени в черния дроб, използвайки RT-PCR анализ. Установена е трансгенна говежда LOX-1 и ендогенна миша LOX-1 иРНК в черния дроб (Допълнителен файл 1: Фигура S1). Ендогенният миши LOX-1 и трансгенният говежди LOX-1 имат сравним интензитет на сигнала за еднакво моларно ниво на LOX-1, както беше съобщено по-рано [24].

Систолично кръвно налягане

Систоличното кръвно налягане беше повишено и в двете HFD и HS/HFD групи в еднаква степен (114,2 ± 0,3 mmHg и 118,4 ± 3,3 mmHg; P Фигура 1

високосоленото

Натрупването на мазнини в черния дроб и чернодробната функция при мишки с различни диетични лечения. а, Представителни чернодробни хистологични находки (HE оцветяване: първоначално увеличение, X100, X400). б, Ефектите от нормалната диета (ND), диетата с високо съдържание на сол и мазнини (HS/HFD), диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) и храненето с HS/HFD плюс 4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметил- пиперидин-н-лечение с оксил (темпол) (HS/HFD Tempol) върху концентрации на чернодробни триглицериди (n = 4-14/група). ° С, Активност на серумна аланин трансаминаза (ALT) (n = 5-11/група). Стойностите са средни стойности ± SEM.

Оценка на NASH по оценка на активността на NAFLD. а, степен на стеатоза. б, клас на балониране с хепатоцити, и ° С, възпалителна степен. д, стадия на фиброза. д, Резултат за активност на NAFLD. Пет точки или повече от оценката за активност на NAFLD бяха оценени за диагностициране на NASH. Плътните линии показват границата на пет точки. n = 6-23/група. Вижте съкращенията в легендите на фигура 1.

Експресия на серумен HA и фибронектин в черния дроб

За да изследваме прогресията на фиброзата при стеатохепатит, оценихме серумните стойности на НА (Фигура 2а). Натоварването със сол повишава НА. Подобно на HA, натоварването със сол повишава експресията на фибронектин в черния дроб на HS/HFD група (2,6 пъти) в сравнение с ND група (P Фигура 4

След това, за да потвърдим натрупването на оксидативен стрес, извършихме имунооцветяване на 4HNE-индуциран протеин в чернодробни секции. Липидната пероксидация е значително повишена в групата с HS/HFD в сравнение с групите с ND или HFD (Фигура 4b). Количествено определихме количеството липидна пероксидация чрез Western blot анализ на 4HNE в черния дроб. 4HNE се увеличава с приблизително 2,0 пъти при HS/HFD (P

Дискусия

Това проучване първо потвърждава, че натоварването със сол върху HFD може да ускори индукцията на NASH. HS/HFD предизвиква значителна мастна дегенерация около чернодробните централни вени, свързана с фиброзни промени. Влошаването на мастния метаболизъм, възпалението и перицелуларната фибороза, наблюдавано при мишки, хранени с HS/HFD, отговаря на критериите на NASH при хора [28], [29], а резултатите на Kleiner са значително по-високи при мишки, хранени с HS/HFD (Фигура 3 ) [29]. Тези фиброзни промени са сравними със серумното ниво на НА и експресията на фибронектин в черния дроб, като и двете са значително повишени при мишки, хранени с HS/HFD.

В настоящия модел натоварването със сол ускорява появата и прогресията на NASH при 8 от 23 мишки (35%) в краткосрочен план (8 седмици) (Фигура 3д). В патологичните критерии на човешки NASH, в допълнение към мастната дегенерация и фиброзата, балонирането на перицелуларните хепатоцити се разглежда като решаваща патологична находка при диагностицирането на NASH при хора. Интересното е, че настоящото проучване потвърждава, че балонирането с хепатоцити е настъпило по-рано от мастната дегенерация в няколко проби, когато е добавено натоварване със сол при мишки, хранени с HFD. В тази група с претоварване със сол хистопатологичните възпалителни и фиброзни промени са по-забележителни, а серумните нива на HA и фибронектин са значително по-високи (Фигура 2а и b) в сравнение с HFD-хранени мишки без претоварване със сол.

Друг забележителен резултат е, че темпол, миметик на SOD, може да намали NASH-подобни хистопатологични промени в черния дроб при мишки, хранени с HS/HFD. Tempol извлича ROS от NADPH оксидаза. Съобщава се, че самата ROS може да активира NADPH оксидаза, вероятно в обратната верига в съдовата система [34] - [36], и от своя страна, намаляването на ROS с радикален чистач, темпол, може да прекъсне дейността на NADPH оксидазата. В настоящото проучване tempol може да възстанови както активността на NADPH оксидаза (Фигура 4а), така и ROS, както е показано чрез експресията на 4HNE (Фигура 4b и c) в черния дроб и образуването на кислородни радикали в клетките на Kupffer след H2O2 предварителна подготовка (Фигура 4d). Тъй като tempol извлича само ROS и няма да повлияе пряко на активността на NADPH оксидазата, механизмът за активиране на обратното предаване между NADPH и ROS може също да присъства в черния дроб [18].

Ограниченията на това проучване включват, че моделът, използван в това проучване, е силно податлив на претоварване с мазнини и натоварването със сол е относително силно. По този начин остава трудно да се определи доколко натоварването със сол увеличава риска от NASH. Освен това подробният механизъм на производство на ROS при зареждане със сол все още е неясен и са необходими допълнителни проучвания. Настоящите резултати обаче ясно показват възможността претоварването със сол да ускори индукцията на NASH при мишки, податливи на HFD. Освен това, нашият модел може да предложи по-добър модел на NASH в сравнение с конвенционалните животински модели, изискващи по-дългосрочни диетични модификации или няколко генни инженеринга. Този модел се характеризира с индуцирано от диетата свръхпроизводство на оксидативен стрес и генетичен произход за MetS. Следователно, той може да се използва за оценка на ефектите както върху околната среда, така и върху генетичното предразположение към NASH.

В заключение, претоварването със сол може да ускори натрупването на оксидативен стрес при условие на консумация на HFD и да индуцира NASH в черния дроб при модел на дислипидемия, LOX-1 Tg и апоЕ KO мишки. Въпреки че е необходимо по-нататъшно проучване, за да се изясни доколко приемът на сол влияе върху производството на ROS и прогресирането на хроничното увреждане на черния дроб, това проучване би предизвикало експерименталния интерес дали приемът на сол е важен за прогресирането на чернодробното заболяване или не.