Роли Формален анализ, Ресурси, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

собственото

Партньорство Unidade de Neonatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Бразилия

Роли Концептуализация, формален анализ, методология, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Партньорство Unidade de Neonatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Бразилия

Роли Формален анализ, методология, ресурси, софтуер, валидиране, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Affiliation Centro Interdisciplinar de Pesquisas em Biotecnologia – CIP-Biotec, Campus São Gabriel, Universidade Federal do Pampa, São Gabriel, Rio Grande do Sul, Бразилия

Разследване на роли, администриране на проекти, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Партньорство Unidade de Neonatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Бразилия

Роли Формален анализ, методология, ресурси, софтуер

Affiliation Centro Interdisciplinar de Pesquisas em Biotecnologia – CIP-Biotec, Campus São Gabriel, Universidade Federal do Pampa, São Gabriel, Rio Grande do Sul, Бразилия

Роли Формален анализ, разследване, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отделение за епидемиология, Колеж по обществено здраве и здравни професии и Медицински колеж, Институт за възникващи патогени, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, Куриране на данни, Официален анализ, Придобиване на финансиране, Разследване, Методология, Администриране на проекти, Ресурси, Надзор, Валидиране, Визуализация, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

Партньорство Unidade de Neonatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Бразилия

  • Адриана Занела,
  • Рита С. Силвейра,
  • Luiz F. W. Roesch,
  • Андреа Л. Корсо,
  • Присила Т. Доблер,
  • Фолкер Май,
  • Ренато С. Процианой

Фигури

Резюме

Обективен

Да се ​​определят разликите в микробиотата на изпражненията на недоносени бебета, като се има предвид използването на изключително мляко и адаптирано мляко в различни пропорции през първите 28 дни от живота.

Методи

Проучването включва новородени с GA ≤ 32 седмици, разделени в 5 групи според режима на хранене: 7 изключителни собствени майчини млека, 8 изключителни предсрочни формули, 16 смесени хранения с> 70% собствено майчино мляко, 16 смесени хранения с> 70% преждевременна формула, и 15 смесени 50% собствено майчино мляко и преждевременна формула. Критерии за изключване: вродени инфекции, вродени малформации и новородени на наркозависими майки. Изпражненията се събират ежеседмично през първите 28 дни. Извършва се микробна екстракция на ДНК, 16S рРНК амплификация и секвениране.

Резултати

Всички групи са сходни в перинаталните и неонаталните данни. Имаше значителни разлики в микробната общност между леченията. Приблизително 37% от вариацията в разстоянието между микробните общности се обяснява с използването на изключително собствено майчино мляко само в сравнение с други диети. Диетата, съставена от ексклузивно собствено майчино мляко, позволява по-голямо богатство на микроби (средно 85 OTU), докато диетите, базирани на за предпочитане адаптирано мляко, изключителна формула, за предпочитане майчино мляко и смесено мляко и майчино мляко, са средно 9, 29, Съответно 23 и 25 OTU. Средният дял на рода Escherichia и Clostridium винаги е бил по-голям при тези, съдържащи адаптирано мляко, отколкото при тези с майчино мляко.

Заключения

Фекалната микробиота в неонаталния период на недоносени бебета, хранени с ексклузивно собствено майчино мляко, показа повишено богатство и разлики в микробния състав от тези, хранени с различни пропорции на адаптирано мляко.

Цитат: Zanella A, Silveira RC, Roesch LFW, Corso AL, Dobbler PT, Mai V, et al. (2019) Влияние на майчиното мляко и различни пропорции на адаптирано мляко върху чревната микробиота на много недоносени новородени. PLoS ONE 14 (5): e0217296. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217296

Редактор: Пол Йенсен, Университет на Илинойс в Урбана-Шампайн, САЩ

Получено: 24 октомври 2018 г .; Прието: 8 май 2019 г .; Публикувано: 20 май 2019 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в ръкописа. Суровите последователности са депозирани в Sequence Read Archive (SRA) под BioProject ID: PRJNA524815. Изпълнете номера SRR8649276 до SRR8649252.

Финансиране: Финансирането беше осигурено от Фондация „Бил и Мелинда Гейтс“ (OPP1107597) и CNPQ и DECIT Ministerio da Saude Brasil. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Незрелата чревна микробиота на недоносени новородени се влияе от фактори като постнатална възраст, гестационна възраст, тегло при раждане и хранителни експозиции [8,13,14,15]. В конкретния случай на кърмене това изглежда прикрива влиянието на теглото при раждане, което предполага защитна функция срещу чревната незрялост на недоносеното новородено в началото на живота [8]. Тези открития предполагат не само съществуването на микробен механизъм, лежащ в основата на доказателствата, които изясняват, че кърмата насърчава чревното здраве на недоносеното новородено [16], но също така и динамичното взаимодействие на гостоприемника и хранителните фактори, които помагат за колонизацията и обогатяването на специфични микроби по време на установяването на чревната му микробиота [8].

Следователно целта на това проучване е да опише чревната микробиота на бебета с много ниско тегло през първите 28 дни в зависимост от употребата на собствено мляко от майката или използването на адаптирано мляко в различни пропорции.

материали и методи

Това проучване използва стратегия за вземане на проби за удобство с пациенти, наети от Неонатологичната секция на Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), Бразилия от май 2014 г. до януари 2017 г. Бременни жени с гестационна възраст ≤ 32 седмици, които предоставят писмено информирано съгласие, са записани в болница допускане за тяхната доставка. Протоколът за проучване е одобрен от Комитета по етика на Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) и настойниците са подписали формуляр за информирано съгласие. Критериите за изключване бяха: 1) ХИВ или вродени инфекции, 2) майки със злоупотреба с вещества и 3) вродени малформации при новородени. Седмичните проби на изпражненията на бебетата се събират от памперси, започвайки от първото изпражнение до 4-та седмица от живота. Всички проби веднага се съхраняват в течен азот до екстракция на ДНК.

Новородените са разделени на пет групи според храненето: ексклузивно собствено майчино мляко (LME), ексклузивна формула (PFL), смесено 50% собствено майчино мляко и 50% адаптирано мляко (MFLM), смесено с адаптирано мляко и 70% или повече от собственото майчино мляко мляко (PLM) и се смесва с майчиното мляко и 70% или повече формула (PFL). Новородените са получавали ежедневно една и съща диета до 28 дни. Различните количества адаптирано мляко и собствено майчино мляко се предлагат отделно, по различно време на деня, така че в края на деня съотношението се запазва. Съотношението между кърмата и адаптираното мляко е ограничението на наличното количество кърма. Използваната преждевременна формула е Pre Nan. Тази формула не съдържа нито пробиотици, нито пребиотици.

Акушерски данни и данни за новородени са събрани в бъдеще.

ДНК екстракция и подготовка на 16S рРНК библиотека

Лабораторната техника, описана подробно по-рано [16].

Микробната ДНК е изолирана от проби с помощта на QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ), следвайки инструкциите на производителя с модификации. Всички ДНК проби се държат при -80 ° С до употреба. V4 регионът на 16S рРНК гена се амплифицира и секвенира, използвайки PGM Ion Torrent платформа (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) с баркодираните бактериални/археални праймери 515F и 806R [17]. PCR амплификацията беше извършена с използване на баркодирани праймери, свързани с Ion адаптер "A" последователност (5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3 ') и Ion адаптер P1 последователност (5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'), за да се получи последователност от праймер, съставен за A- баркод-806R и P1-515F адаптер и грундове. Всяка от 25 μL PCR смес се състои от 2U платинена Taq ДНК полимераза с висока вярност (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ), 4 μL 10X PCR буфер с висока степен на вярност, 2 mM MgSO4, 0,2 mM dNTP, 0,1 μM както 806R баркодирания грунд, така и праймера 515F, 25 μg Ultrapure BSA (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и приблизително 50 ng ДНК шаблон. Използваните условия за PCR бяха: 95 ° С за 5 минути, 35 цикъла на денатурация при 94 ° С за 45 секунди; отгряване при 56 ° C за 45s и удължаване при 72 ° C за 1 min; последвано от крайна стъпка на удължаване при 72 ° С за 10 минути.

Получените PCR продукти бяха пречистени с реагента Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) и крайната концентрация на PCR продукта беше количествено определена с помощта на комплекта Qubit Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) следвайки препоръките на производителя . И накрая, реакциите бяха комбинирани в еквимоларни концентрации, за да се получи смес, съставена от 16S генно усилени фрагменти от всяка проба. Тази композитна проба е използвана за подготовка на библиотека със система Ion OneTouch 2 с шаблон за комплект Ion PGM OT2 400 Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Последователността беше извършена с помощта на Ion PGM Sequencing 400 на Ion PGM System с помощта на Ion 318 Chip v2 с максимум 40 проби на микрочип.

Обработка на последователност

Суровите последователности на 16S рРНК са анализирани в съответствие с препоръките на бразилския проект за микробиоми [18]. Накратко, таблицата OTU (Оперативна таксономична единица) е изградена с помощта на конвейера UPARSE [19], в която четенията са съкратени при 200 bp и качеството е филтрирано с максимална очаквана грешка от 0,5. Филтрираните четения бяха премахнати, а единичните бяха премахнати. След групиране на последователности в OTU, с ограничение на сходство от 97%, химерите бяха проверени, за да се получат представителни последователности за всеки микробен филотип. Таксономичната класификация беше извършена с помощта на SINTAX [20] спрямо базата данни на Ribosomal Database Project (RDP) [21] с праг на доверие от 80%. Усилието за вземане на проби беше оценено, като се използва покритието на Good [22].

Статистически анализ.

Всички клинични данни бяха анализирани с помощта на софтуера SPSS 21.0 при ниво на значимост от 5%. Количествените променливи с нормално разпределение бяха описани чрез средни стойности/SD и сравнени от ANOVA с тест на Tukey. Количествените променливи с асиметрично разпределение бяха описани чрез медиана/интерквартилен диапазон и сравнени чрез теста на Kruskall-Wallis с Dunn Test. За сравнение между пропорциите се използва хира-квадрат тестът на Пиърсън заедно с коригиран анализ на остатъка.

За всички 16S rRNA анализ надолу по веригата, наборът от данни се филтрира, като се запазват само OTU, които присъстват в поне 30% от пробите при всяко третиране и се разреждат до същия брой последователности [23]. Biom файлът беше импортиран в R среда [24] и оценките на алфа и бета разнообразието бяха изчислени с помощта на пакета “phyloseq” [25] и допълнително нанесени с помощта на пакета “ggpltot2”.

За да получи достъп до основните разлики между леченията в това проучване, пермутационен мултивариатен анализ на вариацията (PERMANOVA) [26], както е извършен с помощта на биномиална матрица за различие между пробите и функцията adonis, внедрена във веган пакета [27].

Разликите между леченията бяха достъпни чрез софтуера STAMP [28]. P-стойностите са получени от двустранния непараметричен t-тест на White, последван от корекцията на FDR на Benjamini-Hochberg. Таблица p-стойност 1. Характеристики на субектите.

Данните за новородените са показани в Таблица 2.

Общи разлики в микробната общност между диетите

Разликите в микробната общност на ниво OTU (превишаване на сходството на 97% за определяне на групирането), открити сред проби от фекалии от недоносени новородени, хранени с пет различни диети за период от 28 дни, са представени на фиг. 1. Анализът на ординацията разкри значителни разлики в микробната общност Структурата сред леченията, която предполага, че храненето с различни диети е отговорна за сглобяването на преждевременната чревна общност. Тези разлики бяха допълнително потвърдени от дисперсионния пермутационен многовариатен анализ (Таблица 3).

А и Б. Графика А представлява клъстери от микробни общности. Всяка точка представлява индивидуална проба, с цветове, обозначаващи процедури за хранене. Графика В представя измерване на многовариантна дисперсия за всяко лечение. FLE = изключителна формула; LME = ексклузивно собствено майчино мляко; MFLM = 50% адаптирано мляко и 50% собствено майчино мляко; PFL = ≥70% формула; PLM = ≥70% собствено майчино мляко.

Общите анализи (всички проби) показват, че приблизително 31% от вариацията в разстоянията между леченията се обяснява с различните диети, предвидени във всяко лечение. Сравненията по двойки разкриват, че диети, базирани на майчинско мляко, събрали микробни общности с големи разлики в групата (например по-големи разлики между микробни общности от субекти, хранени с майчино мляко), докато диетите, базирани на формула, са създали повече сходни микробни общности (Фигура 1А и 1В) (Таблица 3 ). Използването на майчиното мляко е отговорно за най-големите вариации, наблюдавани между диетите. Най-голяма вариация между обработките е наблюдавана сред пробите под ексклузивно собствено майчино мляко и проби под ексклузивна формула. Приблизително 37% от вариацията в разстоянието между микробните съобщества може да се обясни с лечението само с майчино мляко (LME) в сравнение с диетата, базирана за предпочитане във формула (PFL).

Освен това, най-големите вариации в разстоянията между леченията са наблюдавани при тези сравнения, включващи използването само на майчино мляко. Приблизително 37% от вариацията в разстоянието между микробните съобщества може да се обясни с лечението само с майчино мляко в сравнение с диетата, базирана за предпочитане във формулата (Таблица 3).

В съгласие с анализа на ординацията, измерванията на алфа разнообразието показват значителни разлики (p-стойност Фигура 2. Брой оперативни таксономични единици, измерени във фекални проби от недоносени бебета, хранени с различни диети в продължение на 28 дни.

Кутиите обхващат първия до третия квартил; хоризонталната линия вътре в кутиите представлява медианата. Мустаците, простиращи се вертикално от кутиите, показват променливост извън горния и долния квартил. Леченията се различават значително според теста на Крускал-Уолис (р-стойност Фигура 3. Диференциално микробно изобилие сред микробни съобщества, открити в проби от недоносени бебета, хранени с различни диети в продължение на 28 дни.