Отделение по анестезиология, Университетски медицински център, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

оток

Отделение по анестезиология, Университетски медицински център, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

Отделение по анестезиология, Университетски медицински център, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

Катедра по анестезиология, Университетски медицински център, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия, Фокусна програма Транслационна неврология, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

Катедра по анестезиология, Университетски медицински център, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия, Фокусна програма Транслационна неврология, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

Отделение по анестезиология, Университетски медицински център, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

Катедра по анестезиология, Университетски медицински център, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия, Фокусна програма Транслационна неврология, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия

  • Ралф Тимару-Каст,
  • Клара Лух,
  • Филип Готард,
  • Changsheng Huang,
  • Майкъл К. Шефер,
  • Кристин Енгелхард,
  • Serge C. Thal

Фигури

Резюме

Цитат: Timaru-Kast R, Luh C, Gotthardt P, Huang C, Schäfer MK, Engelhard K, et al. (2012) Влияние на възрастта върху образуването на мозъчен оток, вторично мозъчно увреждане и възпалителен отговор след мозъчна травма при мишки. PLoS ONE 7 (8): e43829. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043829

Редактор: Кристоф Клайншниц, Юлиус-Максимилианс-Университет Вюрцбург, Германия

Получено: 20 април 2012 г .; Прието: 30 юли 2012 г .; Публикувано: 30 август 2012 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена с безвъзмездни средства от Програма Focus Translational Neurosciences на университета Йоханес Гутенберг към SCT. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Целта на настоящото проучване беше да се изясни дали възрастта влияе върху функционалния изход, системното и мозъчно възпаление, както и вторичното мозъчно увреждане при млади (2 месеца) и възрастни (21 месеца) мишки, подложени на контролирано увреждане на кората на кората (CCI).

Резултати

Смъртност

Смъртност при настаняване на животни.

Животните престояха 630 дни в нашето животно съоръжение до началото на експериментите. От 55 животни 29 мишки са оцелели през този период от време (кумулативна смъртност 45%, виж кривата на Каплан Майер, Фигура 1 А).

A: Крива на Каплан-Майер на степента на оцеляване на старата животинска група. Животните са живели 630 дни в съоръжението за животни до началото на експериментите. От 55 животни 29 мишки са оцелели през този период от време (процент на оцеляване 45%). Кривата на оцеляване демонстрира драстично нарастване на смъртността през последните месеци преди експериментите. Б: Систоличното кръвно налягане [mmHg], измерено неинвазивно при будни животни от двете възрастови групи преди CCI и 6 часа и 24 часа след експериментална TBI. Преди травма систолното кръвно налягане на младите животни е било по-високо, отколкото при възрастни мишки. ° С: Хистологичната оценка на обемите на мозъчното полукълбо на млади (светлосиви, n = 6) и стари (тъмносиви n = 6) неизявени животни разкрива, че двете полукълба са значително по-големи при младите (p Таблица 1. Физиологични параметри I: перитравматично кръвно налягане и телесна температура.

Обем на мозъка в полукълбо

Размерите на мозъка на наивните животни бяха сравнени между двете възрастови групи. Мозъкът на 2-месечни животни е с 8% по-голям в сравнение с 21-месечни животни (р 3 (първично нараняване, 15 минути след TBI) до 32,6 ± 7,7 и 32,5 ± 3,6 mm 3 след 24 часа и 38,2 ± 7,3 и 40,1 ± 12,1 mm 3 след 72 часа при млади и стари животни, съответно. За да се коригират разликите в размера на мозъка, обемите на лезиите също се изчисляват като процент от контралатералните полукълба (Фигура 3 Б). Обемът на лезиите се е увеличил значително 24 часа след CCI в сравнение с първичното увреждане (2 месеца: 10,6 ± 3,2%; 21 месеца: 12,9 ± 1,8%) до 20,0 ± 4,5% (2 месеца) и 20,3 ± 2,6% (21 месеца; p Фигура 2 Типични снимки на оцветени по Нисл коронални разрези на ниво брегма от -0,98 до -1,28 mm на мишки на 2 месеца и 21 месеца на 15 минути (A; B), 24 (C; D) и 72 (E; F) часа след контролирано увреждане на кортикалния удар.

Снимките показват растежа на лезията през първите три дни след черепно-мозъчна травма без разлика между възрастовите групи (вж. Също количествено определяне на лезията, Фигура 3 A, B).

Неврофункционален резултат

Неврологичната функция се определя с оценка за неврологична тежест (NSS, [14]) един час преди CCI (изходно ниво) и 24 и 72 часа след CCI (Фигура 3 В). Преди CCI всички млади животни са изпълнявали задачите без неврологичен дефицит (0 ± 0 точки); като има предвид, че някои стари животни са показали леко нарушен резултат (1,2 ± 1,1 точки; p Таблица 3. Оценка на мозъчната възпалителна експресия на цитокини при наивни животни.

Вече 15 минути след експресия на IL1β (Фигура 4 A, B) увеличава ипсилатерално към лезията и е независим от възрастта до 315 ± 213% от неизявените (2 месеца) и 427 ± 182% от наивните (21 месеца), докато експресията остава стабилна в контралатералните полукълба (2 месеца: 163 ± 98% от 21 месеца: 156 ± 52% от наивните). Експресията достигна максимум при възрастни животни след 24 часа (20037 ± 15676% от наивно) в сравнение с млади животни (995 ± 590% от неизирани). За разлика от това, младите животни демонстрират забавено увеличение 72 часа след обидата (11229 ± 4112% от наивните), което също е по-слабо изразено в сравнение със старите животни (21653 ± 22305% от наивните). В контралатералното полукълбо експресията на IL1β не е била повлияна на 24 часа след травма при 2-месечни животни (247 ± 239% от неизявените), докато при старите животни експресията на IL1β се е увеличила значително и е достигнала максимум 980 ± 744% от наивната. За разлика от това, младите животни демонстрират забавен и по-силен пик на 72 часа след TBI (5302 ± 2947% от наивно), докато експресията на IL1β спада при старите животни до 697 ± 504% от неизираните. Данните предполагат късно и двустранно начало на експресия на IL1β при млади животни, докато при стари животни IL1β увеличава предимно ипсилатерално до увреждане в рамките на 24 часа.

Диференциална експресия на иРНК на интерлевкин 1β (IL1β; Б.), тумор-фактор на некроза α (TNFα; ° С и д) и интерлевкин 6 (IL6; Е. и F) бяха определени при млади (2 месеца, светло сиво) и стари (21 месеца, тъмно сиво) мишки C57/Bl6 на 15 минути (= 15 m, n = 6), 24 часа (= 24 часа, n = 7) и 72 часа (= 72 часа, n = 7) след CCI (данните се нормализират към домакинския ген циклофилин А и се представят като средно ± SD в% от съвпадащите по възраст наивни животни; р-стойностите са коригирани за многократно сравнение от Bonferroni).

Експресията на гена на профила на TNFα показва сходен модел на ранна, предимно едностранна възпалителна реакция при стари животни спрямо късна и глобална регулация на младите животни (Фигура 4 C, D). При млади животни експресията на TNFα се увеличава със забавен пик 72 часа след инсулт в ипсилатерала (15 минути: 710 ± 285% от неизявените; 24 часа: 2814 ± 1323% от неизисканите; 72 часа: 47204 ± 8849% от наивните) и контралатерално полукълба (15 минути: 215 ± 63% от наивно; 24 часа: 721 ± 456% от наивно; 72 часа: 43406 ± 16053% от наивно). При възрастни животни експресията на TNFα достигна своя връх вече 24 часа след инсулт, предимно ипсилатерален (15 минути: 1168 ± 571% от наивно; 24 часа: 18041 ± 11765% от наивно; 72 часа: 15527 ± 12985% от наивно) и до по-ниска степен в контралатералното полукълбо (15 минути: 249 ± 108% от наивно; 24 часа: 2247 ± 1943% от наивно; 72 часа: 689 ± 281% от наивно).

За разлика от последните гени, експресията на IL6 се регулира по различен начин (Фигура 4 E, F). 15 минути след експресията на TBI не се променя ипсилатерално (2 месеца: 228 ± 54% от неизявените; 21 месеца: 251 ± 70% от неизисканите) или контралатерално (2 месеца: 210 ± 78% от неизисканите; 21 месеца: 155 ± 64% на наивно) към лезията. В увреденото полукълбо експресията на IL6 се увеличава независимо от възрастта (2 месеца: 15147 ± 14930% от неизявените; 21 месеца: 10018 ± 9360% от неизявените) и остава повишена след 72 часа (2 месеца: 3985 ± 1575% от наивните; 21 месеца: 4241 ± 3144% от наивно). В контралатералното полукълбо не се наблюдава значително увеличение на 24 часа след CCI (2 месеца: 592 ± 570% от неизявените; 21 месеца: 689 ± 623% от неизявените). Младите животни показват увеличение в 72 часа след TBI (3942 ± 2074% от наивно), докато при стари животни контралатералната експресия на гена IL6 се връща до изходните нива 72 часа след CCI (177 ± 134% от неизисканите). По този начин има ранна и постоянна регулация на IL6 и в двете възрастови групи в ипсилатералното полукълбо, но само късно нарастване на младите животни след 72 часа в контралатералния регион.

Вътремозъчна миграция на Т клетки

Белодробна тРНК експресия на IL1β, IL6, COX2 и iNOS

Експресията на IL1β в белите дробове е била регулирана нагоре при млади животни (15 минути: 187 ± 69% от неизявените; 24 часа: 265 ± 140% от неизявените; 72 часа: 318 ± 145% от неизявените; p Таблица 4. Количествено определяне на кръвта диференциален брой клетки.

И в двете възрастови групи броят на белите кръвни клетки (WBC) се увеличава 15 минути след TBI, без да се достигне ниво на значимост (p = 0,067 и p = 0,381 при млади и стари мишки, съответно). При старите животни 24 часа след TBI WBC се регулира надолу в сравнение с 15-минутни стойности (p + клетки могат да бъдат открити в периконтузионната тъкан. След 72 часа се наблюдава второ увеличение до по-високи нива в сравнение с 24 часа. В контралатералното полукълбо имаше по-слабо изразено увеличение след 72 часа. За разлика от младите мишки, старите животни показаха по-ниско увеличение на Т-клетките в периконтузионната тъкан след 3 дни, докато в контралатералното полукълбо не може да се наблюдава миграция на Т-клетки. Следователно, подобно на модел на експресия на цитокини, количественото определяне на CD3-позитивните Т клетки разкрива двустранен невровъзпалителен отговор по отношение на миграцията на Т клетки на третия посттравматичен ден при млади животни в сравнение с по-едностранния посттравматичен възпалителен отговор при възрастни животни.

Заключения

Настоящото проучване предполага, че освен хистопатологично откриваемото вторично мозъчно увреждане, други механизми могат да бъдат отговорни за нарушен неврологичен изход на възрастни мишки след TBI. Намалената пластичност на старите мозъци, по-високата степен на образуване на оток и променен модел на възпалителен отговор с разлики в миграцията на Т-клетки и експресия на плейотропни възпалителни цитокини и по-ранно начало и по-дълготраен мозъчен възпалителен отговор могат да допринесат за лошото функционално възстановяване на старите животни [9], [13], [23], [24], [37]. Способността на остарелите мозъци да компенсират загубата на невронални клетки след мозъчна травма е до голяма степен нарушена. Ето защо трябва да се обърне внимание на въздействието на възрастта върху възстановяването от TBI [70], за да се разработят терапевтични интервенции, насочени към специфичните проблеми на старите мозъци. Стратегии за разбиране и намаляване на възрастовите разлики могат да помогнат за разработването на фармакологична интервенция за възрастното население.

Материали и методи

Бяха изследвани общо 73 мъжки мишки C57Bl6N (лаборатория Charles River, Sulzfeld, Германия). Млади възрастни мишки (на 2 месеца; 21,2 ± 2,0 g) са сравнени с възрастни животни на 21 месеца (46,8 ± 7,8 g). Това проучване е проведено в съответствие с институционалните насоки на университета Йоханес Гутенберг, Майнц. Всички усилия бяха положени за минимизиране на страданието и броя на животните. Комитетът по грижа за животните и етика на Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz одобри всички експерименти (номер на протокола: G07-1-021). Животните са били държани при контролирана светлина и условия на околната среда (12 часа цикъл тъмно/светлина, 23 ± 1 ° C, 55 ± 5% относителна влажност) и са имали достъп до храна (Altromin, Германия) и вода ad libitum през всички времена преди и след експериментите.

Травматично мозъчно увреждане и експериментални групи

След затваряне на раните, животните от двете възрастови групи бяха разпределени на случаен принцип: 15 минути, 24 и 72 часа оцеляване след спиране на CCI и севофлуран. Животните, които са оцелели 15 минути след CCI, са останали на нагревателната подложка, докато мозъците им бъдат премахнати и кръвта е изтеглена за анализ на артериално-кръвен газ за концентрация на хемоглобин, хематокрит, електролит и нива на глюкоза в кръвта (анализатор на кръвни газове ABL800 BASIC, Radiometer Medical ApS, Brønshøj, Дания). В групите за оцеляване за 24 и 72 часа животните се поставят в индивидуалната им клетка и им се позволява да се възстановят за 6 часа в инкубатор, загрят до 33 ° С и при влажност 35% (IC8000, Draeger, Германия). Образуването на мозъчен оток се оценява 24 часа след експериментална TBI. Хистологичното увреждане на мозъка се определя 15 минути, 24 и 72 часа след травма. CCI групите бяха сравнени с наивни - неоперирани - животни от двете възрастови групи. Неврологичната оценка е извършена преди травма и 24 и 72 часа след TBI. Количествено определяне на невроналното възпаление се извършва в периконтузионна и контралатерална мозъчна тъкан чрез анализ на генната експресия. Използвани са следните експериментални групи.

Експериментални групи (целеви параметри, размер на групата):

  1. Наивни животни, без операция (хематология, неврология, хистология и възпаление):
    1. 2 месеца: n = 6 (n = 6 оцелели)
    2. 21 месеца: n = 6 (n = 6 оцелели)
  2. 15 минути оцеляване (физиология, хематология и хистология):
    1. 2 месеца: n = 6 (n = 6 оцелели)
    2. 21 месеца: n = 6 (n = 6 оцелели)
  3. 24-часово оцеляване (хематология, неврология, хистология и възпаление):
    1. 2 месеца: n = 7 (n = 7 оцелели)
    2. 21 месеца: n = 7 (n = 7 оцелели)
  4. 24-часово оцеляване (кръвно налягане, неврология и съдържание на вода в мозъка):
    1. 2 месеца: n = 8 (n = 8 оцелели)
    2. 21 месеца: n = 10 (n = 8 оцелели)
  5. 72 часа оцеляване (хематология, неврология, хистология и възпаление):
    1. 2 месеца: n = 7 (n = 7 оцелели)
    2. 21 месеца: n = 9 (n = 7 оцелели)

Количествено определяне на функционалния резултат

Преди и след CCI функционалният резултат се определя от изследовател, заслепен към експериментални групи, чрез измерване на телесното тегло и оценка на невроскора. Приложен е 10-точков резултат за неврологична тежест (NSS), както е описано от Tsenter et al. [14]. Неврорезултатът се състои от 10 различни задачи, оценяващи двигателната способност, бдителността, балансирането и общото поведение. Беше присъдена една точка за неуспешно изпълнение на задача. Здравите мишки бяха успешни във всички задачи и получиха 0 точки. Тежко увредени животни са получили до 10 точки (Таблица 5).

Хистологична оценка и имунохистохимия

Количествено определяне на съдържанието на вода в мозъка

Животните бяха повторно анестезирани 24 часа след CCI. След отстраняване на мозъка, малкият мозък се отделя и полукълбите се изрязват по междуплодната сфера. И двете полукълба бяха претеглени, за да се оцени теглото им на мокра повърхност. Полукълбите се сушат в продължение на 24 часа при 110 ° С, за да се определи сухото тегло. Въз основа на гравиметричните разлики, съдържанието на вода в мозъка се получава чрез следното изчисление [75]: Съдържание на полукълбо вода (%): (WW - DW)/WW × 100, където WW е мокрото тегло (g) и DW, сухото тегло (g) на мозъчните полукълба.

Хематологична оценка

Взети са кръвни проби от лявата сърдечна камера под дълбока анестезия преди обезглавяване, както е описано по-горе и се съхраняват в EDTA. Кръвните клетки бяха преброени автоматично чрез флуоресцентно активирано сортиране на клетки (FACS). Хематологичната оценка е извършена в лабораторията на Института по лабораторна медицина към Медицинския център на Университета Йоханес Гутенберг, Майнц, със специално програмирани FACS устройства за кръвни проби от гризачи.

Анализ на генната експресия

Статистически анализ

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Травматично увреждане на мозъка" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Мозъчно увреждане" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Възпаление" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Възрастови групи" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Т клетки" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Цитокини" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Кръвно налягане" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Оток" приложим за тази статия? да не