Присъединяване BioPersMed/Biobank Graz, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

щамове

Присъединяване BioPersMed/Biobank Graz, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Фармацевтичен отдел, Фармацевтична биология, Университет Саарланд, Саарбрюкен, Германия

Фармацевтичен отдел, Фармацевтична биология, Университет Саарланд, Саарбрюкен, Германия

Фармацевтичен отдел, Фармацевтична биотехнология, Университет Саар, Саарбрюкен, Германия, Департамент за микробни природни продукти, Институт за фармацевтични изследвания Helmholtz Saarland (HIPS), Център за изследване на инфекции и фармацевтична биотехнология Helmholtz (HZI), Саарбрюкен, Германия

Фармацевтичен отдел, Фармацевтична биотехнология, Университет Саар, Саарбрюкен, Германия, Департамент за микробни природни продукти, Институт за фармацевтични изследвания Helmholtz Saarland (HIPS), Център за изследване на инфекции и фармацевтична биотехнология Helmholtz (HZI), Саарбрюкен, Германия

Фармацевтичен отдел, Фармацевтична биология, Университет Саарланд, Саарбрюкен, Германия

Институт за биомедицина и здравни науки, Joanneum Research, Грац, Австрия

Партньорски институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Партньорски институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Присъединяване BioPersMed/Biobank Graz, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

  • Вера Х. И. Фенглер,
  • Таня Мачейнер,
  • Соня М. Кеслер,
  • Beate Czepukojc,
  • Катя Гемперлайн,
  • Ролф Мюлер,
  • Александра К. Кимер,
  • Кристоф Магнес,
  • Йоханес Хейбек,
  • Каролин Лакнър

Фигури

Резюме

Цитат: Fengler VHI, Macheiner T, Kessler SM, Czepukojc B, Gemperlein K, Müller R, et al. (2016) Възприемчивост на различни щамове от див тип мишки за развитие на индуцирана от диетата NAFLD/AFLD асоциирана чернодробна болест. PLoS ONE 11 (5): e0155163. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155163

Редактор: Павел Стрнад, RWTH Аахен, ГЕРМАНИЯ

Получено: 5 февруари 2016 г .; Прието: 25 април 2016 г .; Публикувано: 11 май 2016 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от BioPersMed [COMET K-проект 825329], финансиран от Федералното министерство на транспорта, иновациите и технологиите (BMVIT), Федералното министерство на икономиката и труда, Федералното министерство на икономиката, семейството и младежта (BMWA)/BMWFJ) и Щирийската агенция за насърчаване на бизнеса (SFG) (VHIF и KS) и от Федералното министерство на образованието и научните изследвания по номер на проекта [O1KU1216F] (AKK). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Традиционно за моделиране на индуцирани от диетата NAFLD и AFLD мъжки C57BL/6, CD-1 и 129Sv WT щамове на мишки са сред най-често използваните [26-28, 30, 34, 47]. По този начин половите и генетични детерминанти на мишките могат да повлияят на тяхната податливост да развият NAFLD/AFLD. Съобщени са специфични за пола разлики в развитието на NAFLD при мишки. Мъжките гризачи проявяват повишена податливост да развият NAFLD, което е противоположно на наблюденията при хора, където жените изглежда имат по-голямо разпространение на NAFLD [9, 49-51]. Известни генетични детерминанти на мишки C57/BL/6, влияещи върху развитието на NAFLD, включват експресия и активност на стероил-коензим А десатураза 1 (SCD-1), свързващ протеин-1c (SREBP-1) с по-висок стерол [27]. Освен това мишките C57BL/6 изглежда са по-склонни към NAFLD-подобен фенотип, чрез механизми, включващи активиране на макрофаги [52].

Материали и методи

Мишки и диети

Протоколът за животните (BMWF-66.010/0081-II/3b/2012) е одобрен от Комитета за хуманно отношение към животните към Медицинския университет в Грац и Австрийското федерално министерство на науката и научните изследвания Ref. II/3б. Жилището на мишки се извършва с храна и вода ad libitum и се наблюдава в съответствие с Политиката за хуманно отношение към животните на Медицинския университет в Грац.

Мъжете C57BL/6N (C57BL/6), 129S2/Sv (129Sv) и CD-1 мишки (Charles River Laboratories, Германия) бяха настанени групово в индивидуално проветриви клетки в специфично свободно от патогени (SPF) съоръжение с 12 часа светлинен и тъмен цикъл. След период на аклиматизация, мишките на възраст от 8 до 10 седмици бяха съпоставени по тегло и разделени на четири групи (n = 5). Първата група получава течна диета с високо съдържание на мазнини Lieber DeCarli (HF) (46,23% мазнини: 28,17% царевично масло, 16,49% зехтин, 1,57% масло от шафран) (Ssniff, Германия). Втората група се лекува с етанол чрез хранене с течна диета на Lieber DeCarli (EtOH), а третата група получава течна диета с високо съдържание на мазнини Lieber DeCarli, допълнена с етанол (HF + EtOH) [25]. Мишките бяха адаптирани към течна диета преди концентрацията на етанол да се повишава с 1% всеки трети ден до 5% за EtOH и 2,5% за HF + EtOH. Мишките получават HF за 7 седмици, EtOH за 12, 14 и 16 седмици и HF + EtOH съответно за 5, 7 и 9 седмици. Четвъртата група беше жертвана след периода на аклиматизация и служи като нетретирана група. За събиране на тъканни и кръвни проби, мишките се упояват чрез вдишване на изофлуран и се обезглавяват. Пробите от тъкани бяха бързо замразени и съхранявани в течен азот. Допълнителна чернодробна аликвотна част беше фиксирана в 10% формалин.

Биохимични анализи на серумни параметри

Серумът се събира чрез центрофугиране (5000 g, 15 минути, стайна температура). Аспартат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT), серумен TG, серумен холестерол (Roche Diagnostics, Швейцария) и серумни свободни мастни киселини (FFA) (Wako Chemicals GmbH, Япония) бяха определени чрез използване на търговски комплекти за анализ в съответствие с инструкциите на производителя.

Хистологичен анализ

След фиксирането на формалин, черният дроб беше вграден в парафин и разделен на 3 μm. Всички резени бяха оцветени с хематоксилин и еозин (HE) за микроскопско изследване, което беше проведено от двама сертифицирани патологични специалисти (J.H., C.L.) в сляпо проучване. В допълнение, бързо замразени чернодробни проби се разделят на 6 μm и се оцветяват с маслено червено О, за да се илюстрира чернодробното натрупване на липиди.

За количествена оценка на чернодробните ефекти, причинени от различните диетични режими, са оценени стеатоза, възпаление и фиброза, аналогично на оценката за активност NAFLD (NAS) от NASH-CRN [10].

Имуноанализ на параметрите на чернодробното възпаление

Криоконсервирани чернодробни проби се хомогенизират, супернатантите се центрофугират два пъти (16 000 g, 10 минути, 4 ° С) и след това общата концентрация на протеин се измерва с DC протеинов комплект за анализ (Bio-Rad, САЩ). Съдържанието на интерлевкин 6 (IL-6), фактор на туморна некроза α (TNFα) и хемотрактант хемотрактант-1 (MCP-1) в чернодробния моноцит се измерва с ProcartaPlex TM Immunoassay (eBioscience, САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя. По този начин супернатантите на чернодробните хомогенати се разреждат до обща концентрация на протеин от 10 mg/ml и 25 μl от това разреждане се използват за измервания.

Анализ на липидните класове

Извършена е липидна екстракция и анализ на тънкослойна хроматография (TLC), както е описано по-рано, като се използва смес от сярна киселина/етанол за откриване [54]. Накратко, 15 mg от лиофилизирана тъкан се диспергират в хексан/2-пропанол [3: 2 (v/v)] в продължение на 10 минути и се центрофугират при 4 ° С, 10 000 g за 10 минути. Сушената с азот супернатант се разтваря в хлороформ/метанол [1: 1 (обем/обем)] и се нанася върху TLC плаките, които са предварително промити със смес хлороформ/метанол [2: 1 (обем/обем)] и активира се при 110 ° C за 1 h. TLC плочи, заредени с проби и стандартни вещества, първо бяха разработени до средата на плочите в хлороформ/метанол/оцетна киселина/вода [50: 30: 8: 3 (v/v/v/v)] и след това напълно разработени в хептан/диетилов етер/оцетна киселина [70: 30: 2 (обем/обем)]. Съотношението плътност на площта на всяка лента е количествено определено с помощта на софтуера ImageJ.

Анализ на профила на мастна киселина чрез GC-MS

Холестеролът и мастните киселини (FA) на бързо замразени и лиофилизирани проби от чернодробна тъкан се екстрахират с помощта на метода на метилов естер на мастните киселини (FAME) и се измерват с GC-MS, както е публикувано по-рано [55].

статистически анализи

Всички резултати се изразяват като медиани с интерквартилен обхват, ако не е посочено друго. За анализи на данни са използвани Kruskal-Wallis, последвани от Dunns тест на избрани двойки колони или Mann-Whitney U тест. Разликите се считат за значими за стойностите на P от фиг. 1. Увеличаване на теглото и съотношението мастно тегло към телесното тегло на различни диетични групи и щамове мишки.

(A-C) Увеличаването на теглото на HF, EtOH и HF + EtOH групи и различни миши щамове се наблюдава два пъти седмично, което води до индуцирано от режима увеличение на теглото при C57BL/6 и CD-1, но не и при 129Sv мишки. (DF) Съотношения на адипоз към телесно тегло на съответните щамове и диетични групи, показващи повишено подкожно, както и общо съотношение адипоз към телесно тегло при мишки C57BL/6 и 129Sv, докато мишките CD-1 показват само незначителни промени поради HF, EtOH, и HF + EtOH хранене. В края на всеки експеримент се подлагат на дисекция на подкожната, както и на висцералната мастна тъкан, изчисляват се претеглени и подкожни мастни, висцерални мастни и общи мастни съотношения към телесното тегло. Показани са медиани с интерквартилни диапазони и съответните значителни разлики са маркирани със звездичка (Kruskal-Wallis, последвано от тест на Dunns на избрани двойки колони, P стойности на фиг. 2. Серумни нива на TG, общ холестерол, FFA и чернодробна функция, трансаминази AST и ALT на всички групи режими на мишки C57BL/6, CD-1 и 129Sv.

(AE) Метаболитни серумни параметри и нива на трансаминази на мишки C57BL/6 показват значително увеличение на общия серумен холестерол на HF, EtOH 14 седмици и HF + EtOH 9 седмици хранени мишки и намаляване на серумен TG при мишки, хранени с EtOH в продължение на 12 седмици в сравнение с нелекувани мишки. (F-J) Промените в серумните метаболитни и чернодробни параметри на CD-1 мишки, лекувани с режим, доведоха до значително повишени нива на общия холестерол при мишки, хранени с HF и EtOH в продължение на 14 седмици в сравнение с нелекувани аналози. (K-O) Серумни концентрации на метаболитни и чернодробни параметри при 129Sv мишки показват повишено ниво на холестерол в HF групата и повишен AST в HF и EtOH 16-седмични мишки, хранени в сравнение с нелекуваната група. Показани са медиани с интерквартилни диапазони и съответните значителни разлики са маркирани със звездичка (Kruskal-Wallis, последвано от тест на Дънс на избрани двойки колони, P стойности на фиг. 3. Чернодробна хистология, визуализирана чрез оцветяване с HE и Oil Red O, както и количествено определяне на NAS на индуцирано от храната чернодробно заболяване.

Хистопатологичното изследване на черния дроб C57BL/6 разкрива микровезикуларна и лека макровезикуларна стеатоза при HF и HF + EtOH мишки, хранени с мишки. Клетки, наподобяващи балониране, се наблюдават при HF хранене и допълнително в черния дроб на мишки C57BL/6, хранени с HF + EtOH в продължение на 9 седмици и двете диетични групи показват значително по-висок NAS в сравнение с нетретираната група. Групите, хранени с EtOH, показват повишена стеатоза и възпаление, но без балониране (Фигура 3 и Таблица 1).

При CD-1 мишки диетичните режими водят до незначителни характеристики на NAFLD/AFLD, тъй като почти не се наблюдава стеатоза. Балонирането също не се е случило и възпалителните клетки са рядкост. В сравнение с нелекуваната група, NAS е само значително увеличен в групата, хранена с EtOH в продължение на 16 седмици, докато това се дължи главно на повишено възпаление (Фигура 3 и Таблица 1).

За разлика от тях, 129Sv черен дроб проявява умерена стеатоза, присъстваща в почти всички черни дроб, получени от трите различни диетични групи. Балонирането обаче не е показано в нито един от черния дроб на 129Sv мишки. Възпалителна клетъчна инфилтрация беше забелязана на видно място в групи, хранени с EtOH и HF + EtOH и се издигаше от най-кратката до най-дългата продължителност на хранене (Фигура 3 и Таблица 1).

Освен това, при нито една от нелекуваните или третирани с режим мишки не е наблюдавана нито една щам фиброза.

Статистическата корелация на NAS и диетичните режими в сравнение с мишки C57BL/6, CD-1 и 129Sv е показана в таблица S1 (таблица S1).

Възпалителен отговор в черния дроб на мишки с високо съдържание на мазнини и етанол

За количествено определяне на възпалението в черния дроб на мишки, лекувани с хранителен режим, в чернодробната тъкан са измерени интерлевкин-6 (IL-6), фактор на туморна некроза алфа (TNFα) и моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) и резултатите са показани на фигура 4 Нивото на IL-6 при нелекувани мишки C57BL/6 е било поне 1,3 пъти по-високо от това при мишки от различните диетични групи, което е в съответствие с предишни доклади, в които повишените чернодробни нива на IL-6 съответстват на здравия черен дроб, за разлика от повишен системен IL-6, който е свързан с NAFLD/AFLD [48, 56-58]. 7 седмици HF и HF + EtOH хранене значително намаляват нивото на IL-6 на мишки C57BL/6 в сравнение с нетретираните мишки (Фигура 4А). TNFα притежава ключова роля в развитието на стеатохепатит чрез засилване на фиброзата [57, 58] и чернодробният TNFα е значително увеличен при EtOH, хранени с мишки C57BL/6 в сравнение с нелекувани мишки (Фигура 4А). MCP-1 е важен за набирането на моноцити/макрофаги в черния дроб и се смята, че инициира възпаление при NAFDL/AFLD [32, 59]. Храненето с EtOH в продължение на 14 седмици повишава чернодробния MCP-1 при мишки C57BL/6 значително в сравнение с липса на лечение (Фигура 4А).

Маркерите за възпаление се определят от чернодробните хомогенати на всички черни дроб на съответните миши щамове и диетични групи. Нива на IL-6, TNFα и MCP-1 на мишки (A) C57BL/6, (B) CD-1 мишки и (C) 129Sv мишки, показващи възпалителен отговор при мишки C57BL/6 и 129Sv чрез намален чернодробен IL- 6 и увеличени чернодробни концентрации на TNFα и MCP-1 поради режим на хранене. Дадени са медиани с интерквартилни диапазони и съответните значителни разлики са отбелязани със звездичка (Kruskal-Wallis, последвано от тест на Dunns на избрани двойки колони, P стойности от фиг. 5. Определяне на чернодробния липиден профил на CD-1 и 129Sv мишки, лекувани с режим.

Чернодробното съдържание на липиди се определя от черния дроб от режими, хранени с мишки CD-1 и 129Sv чрез полуколичествен хроматографски метод и се показва като относително количество в сравнение с нетретираните аналози. (A) Нивата на TG бяха увеличени и при двата миши щама, с повишено съхранение на чернодробен TG при 129Sv мишки в сравнение с CD-1 мишки. (B) Свободният холестерол се променя само в някои от режимите, лекувани 129Sv мишки, включително намален свободен холестерол в хранене група EtOH 14 седмици и повишен свободен холестерол в HF + EtOH, хранени в продължение на 7 и 9 седмици. (C) CE, както и (D) CER нивата бяха повишени във всички хранещи се групи от двата щама, с по-високо съдържание на CE при 129Sv мишки в сравнение с CD-1 мишки. (E) Нивата на PC не се променят при CD-1 мишки, докато HF храненето в продължение на 7 седмици причинява повишено съдържание на PC и HF + EtOH храненето в продължение на 7 седмици причинява намалени нива на PC. (F) Съдържанието на РЕ беше сходно и при двата щама, без промени между нетретирани и третирани с режим мишки. Стойностите са дадени като средни стойности със стандартни отклонения, а съответните значими разлики са отбелязани със звездичка (U-тест на Mann-Whitney, P стойности от фиг. 6. FA състав на режим, третиран с мишки 129Sv черен дроб.