Волтажният протонен канал Hv1 медиира функцията на NADPH оксидаза (NOX) чрез регулиране на вътреклетъчното рН по време на дихателни изблици.

напрежение

В адипоцитите излишните хранителни вещества активират пентозофосфатния път, който е основен източник на клетъчен NADPH и води до активиране на NOX.

Какви са новите открития?

Делецията на Hv1 води до значително увеличаване на телесното тегло и мастно натрупване, когато хранителните вещества са достатъчни.

Мишките с дефицит на Hv1 развиват по-голяма непоносимост към глюкоза, но няма значителна разлика в инсулиновата резистентност в сравнение с WT чрез хранително предизвикателство.

Недостигът на Hv1 допринася за чернодробна стеатоза и възпаление.

Как тези резултати могат да променят фокуса на научните изследвания или клиничната практика?

Hv1 като регулатор на метаболитната хомеостаза в мастната тъкан играе антиадипогенезна роля in vivo.

Въведение

Затлъстяването се причинява от излишната енергия от глюкоза или мастни киселини, депонирани като триглицериди (TG) в адипоцитите и се характеризира с хипертрофия на адипоцитите и натрупване на макрофаги, което е свързано с възпаление и инсулинова резистентност. активира NADPH оксидаза (NOX) и пентозофосфатния път (PPP), който е основен източник на клетъчен NADPH и води до активиране на NOX, вместо да се метаболизира чрез митохондриално окисление в адипоцитите. до кислород за генериране на супероксид.

Дейностите на NOX се регулират от механизмите за самообвързване чрез тяхната електрогенна активност и чувствителност към вътреклетъчно рН.5–9 Хендерсън и др. 5-7 съобщават, че вътреклетъчните промени в рН са свързани с дейностите на NOX, които поддържат образуването на супероксид и могат да да бъдат ограничени от движението на компенсиращ заряд в човешките неутрофили и те ги определят като H + -проводими канали. Освен това Morgan et al10 предоставят първите преки и най-силни доказателства, че протонният канал Hv1 с напрежение е от съществено значение за регулирането на pHi в отделни клетки, което е първият транспортер, който регулира pH по време на дихателния взрив на фагоцитите.

Напоследък реактивните кислородни видове (ROS) са замесени като важен фактор за патогенезата на свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност12, които играят ключова роля в предаването на вътреклетъчния инсулинов сигнал и упражняват защитен ефект срещу появата на индуциран от диетата инсулин резистентност.13 14 Въпреки тясната връзка между затлъстяването, производството на ROS и активността на NOX, ролята на Hv1 в началото на инсулиновата резистентност, възпалението на адипоцитите и набирането на макрофаги в мастната тъкан по време на развитието на затлъстяването все още не е изследвана.

Тук изследвахме метаболитния фенотип на мишки с генетична аблация на Hv1 и отговора им на предизвикателството с високо съдържание на мазнини (HFD). Нашите данни демонстрират, че при хранене с HFD, мишките с дефицит на Hv1 са по-чувствителни към развитието на затлъстяване, предизвикано от диетата и чернодробна стеатоза с молекулярен подпис на възпалението и NOX. За първи път установихме, че Hv1-дефицитът повишава чувствителността към развитието на метаболитни нарушения при хранителни предизвикателства и води до затлъстяване. Нашите данни предполагат, че Hv1 може да медиира NOX за регулиране на функцията на мастната тъкан и защита срещу затлъстяване.

Експериментални процедури

Животни и диети

Мишки, носещи целенасочено прекъсване в Hv1/VSOP (Hv1 -/-/VSOP, обратно кръстосани осем пъти) бяха любезно предоставени от д-р Y Okamura (Медицински факултет, Университет в Осака), както беше описано по-рано. 15 WT мишки (Hv1 +/+/VSOP) са от същия генетичен произход (C57BL/6J). Животните бяха държани в съоръжение без патогени при 12-часов цикъл светлина-тъмнина с достъп до вода и стандартна миша диета (Lillico Biotechnology) при постоянна температура (23 ° C). Генотипизирането се извършва чрез PCR, както е описано от Ramsey et al. 11 За затлъстяване, предизвикано от диета, мишките се хранят с HFD, съдържащ 45% мастни калории, 35% въглехидратни калории и 20% протеинови калории (4.73 kcal/g) (D12451; Изследвания Диети) от 5-седмична възраст в продължение на 16 седмици. Теглото на тялото се измерва седмично.

Серумна биохимия

Нивата на кръвната захар се измерват от кръв, получена от вената на опашката след гладуване 6 часа с помощта на автоматизиран глюкомер (One Touch, Johnson & Johnson, USA), и се измерват серумни концентрации на TG и общ холестерол (TC) (BOMEI биотехнология, Китай), според инструкциите на производителя. Нивата на серумен инсулин се измерват с помощта на ELISA (Mercodia, Uppsala) съгласно инструкциите на производителя.

Тест за инсулинов толеранс (ITT) и глюкозен толеранс (GTT)

ITT и GTT бяха извършени след 6-часово гладуване. Мишките се инжектират интраперитонеално (ip) с биосинтетичен човешки инсулин (0,75 U/kg телесно тегло) (Novo Nordisk A/S) или стерилна 20% глюкоза в PBS (2 g/kg телесно тегло). Нивата на плазмената глюкоза се проследяват в определено време след инжектирането (One Touch, Johnson & Johnson, USA). Междувременно, венозна кръв се събира след инжектиране на глюкоза ip при 0, 2, 5, 15 и 30 минути в охладени хепаринизирани епруветки, веднага се центрофугира и серумът се съхранява при -80 ° C.

Събиране на тъкани и хистология

Всички животински тъкани на черния дроб и епидидималната мастна киселина бяха отстранени и претеглени незабавно. За анализ на Oil Red O (ORO) част, съдържаща приблизително една пета от всеки черен дроб, беше вградена в съединение с оптимална температура на рязане (Tissue-Tek, Sakura Finetek, САЩ), замразено върху сух лед и съхранено при -80 ° C за бъдещи секциониране. Впоследствие серийни секции с дебелина 7 μm бяха събрани върху предметни стъкла, покрити с поли-D-лизин. Срезите бяха оцветени с ORO и хематоксилин (BASO) съгласно инструкциите на производителя. За хистология, проби от черен дроб и епидидимална мастна маса бяха фиксирани в 4% буфериран формалин, вградени в парафин и нарязани на 5 µm секции за H&E. Размерът на адипоцитите беше измерен с помощта на софтуера ImageJ. Епидидималните мастни тъкани за екстракция на РНК бяха бързо замразени в течен азот по време на събирането и по-късно смлени до фин прах с помощта на стерилен пестик и хоросан върху течен азот.

Имунохистохимия

Секции от фиксирана с формалин, вградена в парафин тъкан се инкубират за една нощ при 4 ° С с CD68 заешко поликлонално антитяло (разреждане 1: 500; Proteintech). Секциите се промиват три пъти в PBS, инкубират се с биотинилирано козе антирабитско вторично антитяло (Sigma-Aldrich) за 1 час и след това се добавят пероксид и пероксидазен субстрат. Макрофагите се определят количествено чрез преброяване на CD68-положителна зона. Оцветените филийки бяха разгледани под обърнат микроскоп (eclipse Ti, Nikon), използвайки цифрова система за изображения (NIS-Elements, Nikon).

Количествена PCR в реално време

Обща РНК се изолира от епидидимална мастна, използвайки колони RNeasy Mini (Qiagen). Безплатна ДНК се генерира от 600 ng РНК, като се използва едноетапно отстраняване на gDNA и супер микс за синтез на cDNA (Transgen) в 20 uL реакционна смес. Реакциите се провеждат в два екземпляра за всяка проба и се определят количествено в PCI система в реално време ViiA 7 (Applied Biosystems). Стойностите на Ct бяха нормализирани спрямо референтния ген GAPDH и относителната генна експресия беше изчислена с метода 2 - △△ Ct. 16 Използвани бяха генно специфични праймери на мишки, както е посочено в таблица 1.