Обективен Чревната микробиота е основният източник на инфекции при некротизиращ панкреатит. Изследвахме ефекта от нарушаването на чревната микробиота от западен тип диета върху смъртността и разпространението на бактерии при некротизиращ панкреатит и неговото обръщане чрез добавяне на бутират.

диета

Дизайн Мишките C57BL/6 бяха хранени или със стандартна чау, или с диета от западен тип в продължение на 4 седмици и след това бяха подложени на индуциран от таурохолат некротизиращ панкреатит. Кръв и панкреас бяха събрани за бактериология и имунен анализ. Съставът на микробиотата на цекума при мишките беше анализиран, като се използва последователност от 16S рРНК генни ампликони и метаболитите на цекално съдържание бяха анализирани чрез целенасочена (т.е. бутират) и нецелена метаболомика. Предотвратяването на некротизиращ панкреатит в този модел е сравнено между трансплантация на фекална микробиота (FMT) от здрави мишки, дезактивация на антибиотици срещу Грам-отрицателни бактерии и перорално или системно приложение на бутират. Освен това се анализира фекалната микробиота на пациенти с панкреатит и здрави индивиди.

Резултати Смъртността, системното възпаление и разпространението на бактерии бяха увеличени при мишки, хранени със западна диета, и чревната им микробиота се характеризира със загуба на разнообразие, цъфтеж на Escherichia coli и променен метаболитен профил с изчерпване на бутирата. Докато обеззаразяването с антибиотици намалява смъртността, Грам-положителното разпространение се увеличава. Както пероралното, така и системното добавяне на бутират намаляват смъртността, разпространението на бактерии и обръщат промените в микробиотата. Парадоксално е, че смъртността и разпространението на бактерии се увеличават с приложението на FMT. И накрая, пациентите с остър панкреатит демонстрират увеличение на протеобактериите и намаляване на производителите на бутират в сравнение със здрави индивиди.

Заключение Изчерпването на бутирата и неговото напълване изглежда играят централна роля в прогресията на болестта към некротизиращ панкреатит.

  • остър панкреатит
  • бактериална инфекция
  • диета
  • бутират
  • антибиотици

Това е статия с отворен достъп, разпространявана в съответствие с лиценза Creative Commons Attribution 4.0 Unported (CC BY 4.0), който позволява на другите да копират, преразпределят, ремиксират, трансформират и надграждат тази творба за всякакви цели, при условие че оригиналната творба е правилно цитирана, дава се връзка към лиценза и посочва дали са направени промени. Вижте: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Статистика от Altmetric.com

Значение на това проучване

Това, което вече е известно по този въпрос?

Чревната микробиота е засегната при пациенти с остър панкреатит в сравнение със здрави индивиди.

Микробите, които причиняват вторична инфекция на некротизиращ панкреатит, произхождат от стомашно-чревния тракт.

Повишената чревна пропускливост и променената микробиота на червата след остър некротизиращ панкреатит са свързани с инфекциозни усложнения.

Затлъстяването е рисков фактор за неблагоприятен изход чрез увеличаване на (пери) панкреатични инфекции и възпаления, въпреки че механизмът е неясен.

Какви са новите открития?

Западно диетично хранене влошава експерименталния остър некротизиращ панкреатит чрез увеличаване на бактериалното разпространение и променя чревния метаболитен профил с изчерпване на късоверижните мастни киселини.

Escherichia coli доминира сред микробиотата на мишки с панкреатит, хранени със западна диета, и селективното Грам-отрицателно обеззаразяване атенюира Грам-отрицателните бактерии, но обратно увеличава Грам-положителното разпространение на бактерии.

При миши модел на остър некротизиращ панкреатит трансплантацията на фекална микробиота увеличава бактериалното разпространение и смъртност. За разлика от това, добавянето на бутират, както индукции на препанкреатит, така и на постпанкреатит, отслабва прогресията на заболяването при мишки.

Значение на това проучване

Как може да се отрази на клиничната практика в обозримо бъдеще?

Нашето проучване показва, че профилактичното приложение на бутират при пациенти с остър панкреатит е потенциална стратегия за предотвратяване прогресирането на заболяването при това потенциално летално заболяване.

Въведение

Остър панкреатит (AP) има глобална честота от 33,74 случая и 1,6 смъртни случая на 100 000 човеко-години.1 Тежките инфекции често са изтощителни и са основна причина за смъртност при тези пациенти. Най-често пробите от кръв, храчки и панкреас са културно положителни за бактерии, които обикновено живеят с ниско количество в стомашно-чревния тракт, като Escherichia coli, Klebsiella spp и Enterococcus spp. Бактериемията е рисков фактор за и често предшества появата на инфектиран некротизиращ панкреатит.2 Предишни проучвания показват, че повишената пропускливост на чревната бариера и променената чревна микробиота са свързани с инфекциозни усложнения.3 4 Това подкрепя идеята, че заразеният некротизиращ панкреатит може да бъде причинени от чревни бактерии, които се преместват в (пери) колекции на панкреаса.

В това проучване предположихме, че може да се идентифицира променен състав и функционален капацитет на чревната микробиота, който предшества и предсказва появата на остър некротизиращ панкреатит (ANP) и е преувеличен от приемането на диета от западен тип (WD). Следователно целта на това проучване е да се оцени ролята на чревната микробиота върху развитието на ANP при мишки, хранени с WD. Резултатите разкриват пряка връзка между изчерпването на коменсалната микробиота и леталните инфекции в AP, което може да бъде предотвратено чрез приложение на бутират и в по-малка степен чрез обеззаразяване с антибиотици, но не и чрез трансплантация на фекална микробиота (FMT). Оценката на ролята на микробиотата в ANP в контекста на западна диета може да информира за нова превантивна терапия.

Материали и методи

Бяха закупени мишки C57BL/6 на възраст от шест седмици до осем седмици (Charles River Laboratories International, Wilmington, Massachusetts, USA) и настанени при стандартни условия (12 часа цикъл тъмно/светло) в продължение на най-малко 72 часа, преди да бъдат проведени каквито и да било процедури за изследване изпълнени. Животните са имали свободен достъп до чешмяна вода и стандартна диета с чау (SD), или WD, съдържаща 60% полиненаситени мастни киселини (S3282, Bio-Serv, Flemington, Ню Джърси, САЩ) и без разтворими фибри, както беше описано по-рано. 5 Животните бяха умъртвени чрез задушаване на СО или 24 часа, или 72 часа след операцията, или когато умира. Кръвта е взета чрез сърдечна пункция, последвано от асептично отстраняване на панкреаса и тъканта на цекума и съдържанието. Аликвотни части се съхраняват при -80 ° С до анализ.

Миши модел на жлъчен, некротизиращ панкреатит

Некротизиращият панкреатит се предизвиква чрез инфузия на панкреатичния канал с таурохолатна киселина (ТА), както е описано по-рано.6 Подробно описание на процедурите е предоставено в онлайн допълнителните методи.

Допълнителен материал

Лечения

За перорално добавяне на бутират, маслена киселина (100 mM, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, USA) се добавя към питейната вода (сменя се ежеседмично) в продължение на 4 седмици преди процедурата. За лечение със системен бутират или хистон деацетилаза (HDAC) инхибитор, животните се инжектират интраперитонеално с 500 uL натриев бутират (40 mM) или трихостатин А (TSA 133 μg/ml) в стерилен физиологичен разтвор на 0, 7 и 14 часа следоперативно. Контролните групи се инжектират с 500 uL стерилен физиологичен разтвор.

След 23 дни хранене с WD се извършва селективно грам-отрицателно изчерпване на червата (GNGD) чрез орално измерване на неомицин (100 mg/kg телесно тегло) и полимиксин В (25 mg/kg телесно тегло), разтворени в стерилен физиологичен разтвор два пъти на ден в продължение на 5 дни.7 Контролната група е получавала нормална питейна вода без добавки.

За трансплантациите на фекалии, свежи фекални пелети бяха събрани от 6-седмични до 8-седмични мишки C57BL/6 във физиологичен разтвор с крайна концентрация от 50 mg фекалии/ml. Събраните проби се центрофугират (100 х g за 2 минути), за да се гранулират големи частици и супернатантата се използва за третиране с FMT. За стерилен фекален филтрат (SFF), супернатантите се събират и преминават през 30, 0,45 и 0,22 µm филтри (Millipore). Общо 200 µL FMT или SFF се прилагат на мишки чрез орален сондаж, започвайки приблизително 1 час след процедурата и след това на всеки 24 часа до умъртвяването.

Анализ на микрочипове на бактериален фенотип, целенасочени (късоверижни мастни киселини) и нецелена метаболомика

След умъртвяването се събира съдържанието на цекума, замразява се бързо и се съхранява при -80 ° C до анализ. За анализ на микрочипове на бактериален фенотип, аликвотна част се съхранява в 10% глицерол. Анализът беше извършен върху GEN-III Biolog плаки, както беше описано по-горе.5 Анализът на целева газова хроматография-масова спектрометрия (GC-MS) беше извършен за измерване на късоверижни мастни киселини (SCFAs). Нецелевият GC-MS анализ беше анотиран с библиотеката на Fiehn GC-MS за метаболити RTL. Подробни процедури за фенотипния микрочип и метаболомичния анализ са предоставени в онлайн допълнителния файл.

Последователност на 16S rRNA ген ампликон

Микробната ДНК беше извлечена от тъканите на цекума и съдържанието с помощта на MagAttract PowerMicrobiome DNA/RNA KF комплект. Ампликоните на V4 региона на гена 16S рРНК са конструирани с помощта на двойка праймери 515F/806R, съгласно протоколите на Earth Microbiome Project (http://www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/16s/). Последователността на Amplicon беше направена на платформа MiSeq (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ) в съоръжението за секвениране Argonne, генерираща 150 bp четения на двойки.8 Проследяването напред и назад беше обединено с помощта на USEARCH V.3.10 Amplicon Sequence Varijante (ASVs) ) бяха изведени за използване на UNOISE V.3 и четенията бяха картографирани спрямо набора ASV за определяне на изобилието. Таксономията беше присвоена с помощта на класификатора на проекта Ribosomal Database Project (RDP) 11 и SILVA12 16S рибозомна база данни V.132. Панел от производители на бутират, базиран на таксономия на рода, е изграден въз основа на таксани, произвеждащи бутират (онлайн допълнителна таблица 1).

Допълнителен материал

Пациенти

Включени са тридесет и пет холандски пациенти с предсказан тежък AP (SAP), които са участвали в проучването „Пробиотична профилактика при предсказан тежък остър панкреатит“ (PROPATRIA) с налични проби на изпражненията.14 Пациенти, участвали в това проучване, са получавали пробиотици или плацебо след рандомизация . Проби от изпражнения се събират в рамките на 72 часа след приема, преди рандомизиране и приложение на изследваните продукти. Тежестта се определя като SAP (умерено тежко или SAP) или леко AP (MAP) съгласно преразгледаните критерии на Атланта. Освен това, 15 здрави, непушачи, кавказки доброволци от мъжки пол, които бяха част от проекта MISSION-2 (NCT02127749), без предишно излагане на антибиотици за последната година бяха включени като контролна група.15 16 Проби от изпражнения бяха събрани и незабавно съхранени при -20 ° C до по-нататъшен анализ. Процедурите за изолиране на ДНК и секвениране на 16S rRNA ген ампликон на проби от човешки изпражнения са предоставени в допълнителните онлайн методи.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на GraphPad Prism V.8 (Graphpad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ) или R (R Core Team, https://www.R-project.org/). Освен ако не е посочено друго, резултатите са изразени като средно ± SD. Непараметричният t-тест на Mann-Whitney или Student беше използван за тестване на статистическа значимост в зависимост от разпределението на нормалността. Пакетът с функция „DESeq“ „DSEeq V.2“ е използван за значимост на относителното изобилие на метаболити за еднофакторния метаболомичен анализ.17 Дисперсионният анализ (ANOVA) е използван за тестване на значителни разлики между множество групи. Пермутационната многовариантна ANOVA (PERMANOVA) е използвана за групово сравняване на мерки за бета-разнообразие, използвайки „adonis“ от пакета „vegan“. 18 Тестът за ранг на лога е използван за тестване на значимостта в кривите на Kaplan-Meyer (Prism V.8) . Тест за значимост, базиран на кръстосана (моделна) валидация с 999 пермутации, беше използван за тестване на значителни разлики между две групи за анализ на разредени частични най-малки квадрати (sPLS-DA), като се използва функцията „MWA.test“ на „RVAideMemoire „пакет.19

Резултати

Инфузията на TA в панкреатичния канал предизвиква ANP и смъртност при мишки, хранени с WD

ANP се индуцира чрез ретроградна инфузия на панкреатичния канал с ТА при мишки (фигура 1А). Некротизиращият панкреатит се развива както при SD панкреатит (SD + ANP), така и при WD панкреатит (WD + ANP), което се потвърждава от повишена серумна амилаза (фигура 1В). Макроскопска екстрапанкреатична мастна некроза и микроскопична фокална панкреатична некроза са наблюдавани и в двете групи (фигура 1С). Хистологичният резултат, отчитащ степента на некроза, некротичната област и възпалението, както е описано по-рано6, е сравним сред SD + ANP и WD + ANP мишки (фигура 1D). Четири седмици WD хранене само по себе си доведе до увеличаване на телесното тегло (вж. Онлайн допълнителна фигура 1А) и леко повишено ниво на серумен ендотоксин (вж. Онлайн допълнителна фигура 1B). Индукцията на ANP доведе до значително увеличаване на ендотоксина както при SD-хранени, така и при WD-хранени мишки (вж. Онлайн допълнителна фигура 1С). Въпреки това, 64% смъртност (9 от 14) е наблюдавана при WD панкреатитни мишки, където не са наблюдавани смъртни случаи в SD групата на панкреатит (фигура 1Е). Това корелира с увеличеното системно възпаление в групата WD + ANP в сравнение с групата SD + ANP, измерено на 24 часа след операцията (фигура 1F, G).

Допълнителен материал

Късоверижни мастни киселини в цекума на ANP мишки. (A – C) Целева газова хроматография-масспектрометричен анализ на съдържанието на цекума за бутират (p 0,05) (C), всички чрез несдвоен t-тест. * р 8/ml кръв е идентифицирана.

16S рРНК анализ на човешки проби. (А) Относително изобилие от микробиота на ниво филус във фекалиите на 15 здрави доброволци (HV) и 36 пациенти с остър панкреатит (AP), включително 26 пациенти с лека AP (MAP) и девет пациенти с тежка AP (SAP). (B) Протеобактериите са значително увеличени в AP в сравнение с HV (p = 0,0002). Не са наблюдавани разлики между MAP и SAP (p = 0,224, и двете чрез теста на Mann-Whitney). (В) Относително изобилие от микробиота на ниво род. Blautia, Akkermansia и Escherichia/Shigella са сред доминиращите видове в MAP, докато Escherichia/Shigella, Enterococcus и Streptococcus - при пациенти със SAP. При двама пациенти със SAP се наблюдава почти монокултурна общност на ниво род (Enterococcus и Streptococcus), както е показано със стрелки. (D) Относителното изобилие от Escherichia/Shigella е значително увеличено в AP в сравнение с HV (p 90%), изчерпване на SCFA (> 90%) и свръхрастеж на протеобактерии (т.е. E. coli) .5 39–41 Нашите текущи данни предполагат, че независимото от диета обогатяване на рибоза, субстрат, който може да служи като единствен енергиен източник за Е. coli, 42 може отчасти да обясни стомашно-чревния свръхрастеж на E. coli в нашия модел. Точните механизми за този отговор обаче остават неизвестни и се разследват.

Това проучване е в съгласие с нарастващ набор от доказателства, демонстриращи защитната роля на здравата чревна микробна екосистема за защита срещу ендогенна микробиота с ниско количество, която може да цъфти при условия като ANP, както и срещу нахлуване на екзогенни патогени.5 43–45 Бутират, SCFA, произведен от чревни коменсали, е основният енергиен източник за колоноцитите, за разлика от дълговерижните мастни киселини, които са слабо използвани.46 Нашето проучване показа много значително изчерпване на SCFA, въглехидрати и аминокиселини, които са свързани с Хранене с WD и ANP. Обратно, имаше увеличение на дълговерижните мастни киселини олеинова киселина, метилолеат и палмитолеинова киселина. Въз основа на тези резултати може да се предположи, че липсата на използваеми метаболитни субстрати и увеличаването на жлъчните киселини водят до атрофия, възпаление и повишена чревна пропускливост. Осигуряването на критичен енергиен източник вероятно допринася за атенюираното бактериално разпространение и смъртност, наблюдавано при добавяне на бутират. Това се потвърждава от скорошни доказателства, които показват, че добавянето на перорален бутират частично обръща повишената пропускливост на червата и дисбиозата, причинени от храненето с WD с високо съдържание на мазнини.47 48

Последните проучвания показват, че SCFAs могат да осигурят защита срещу Clostridium difficile collitis49 и колонизация със Salmonella50 и Candida albicans.51 Бутиратът регулира функцията на макрофагите чрез инхибиране на HDAC и ги насочва към антимикробен фенотип по време на съзряването.24 52 Тези имунологични антимикробни ефекти, медиирани от HDAC инхибиране, може да е в основата на механизма за отслабване на ANP със системен бутират в нашия модел. Въпреки това, лечението с TSA, мощен HDAC инхибитор, не осигурява защита в нашия модел. Селективността на бутирата и TSA за класифицираните HDAC се различава, демонстрирано от факта, че чревните епителни клетки реагират по различен начин в тяхно присъствие. Друго обяснение са добавените ефекти на бутирата върху имунния отговор, пропускливостта на червата и локално върху чревната микробиота. Необходима е по-нататъшна работа, за да се изключи напълно благоприятният ефект на HDAC инхибиторите в този модел.

Наскоро Американската администрация по храните и лекарствата издаде предупреждение за безопасност за употребата на FMT след съобщения за сериозни неблагоприятни ефекти, включително една смърт, поради инфекции с мултирезистентни бактерии.54 Нашите констатации освен това показват, че е необходимо изключително внимание при обмисляне на приложение на живи бактерии в клинична или експериментална среда за тази тежко болна популация. Терапевтичното използване на така наречените постбиотици - бактериални метаболити или компоненти, които се отделят при лизис на бактерии - стават все по-популярни цели поради тяхната потенциална сила и полезен профил на безопасност.55 56

В обобщение, резултатите от настоящото проучване предоставят убедителни доказателства, че диетата и нейното взаимодействие с чревната микробиота могат да имат силен ефект върху хода и резултата от ANP. Резултатите от това проучване също така определят границите и рисковете от използването на FMT и антибиотици за предотвратяване на смъртността от ANP при WD мишки. Нови подходи за предотвратяване на прогресирането на пациенти, които имат клиничен панкреатит към заразена панкреатична некроза, могат да бъдат информирани от това проучване, което предполага, че наличността на хранителни вещества - сред другите постбиотици като бутират - за микробиотата може да бъде по-рационална стратегия.

Благодарности

Признаваме Центъра за човешки тъкани в Чикагския университет за подготовката на хистологични диапозитиви. Благодарим на Joanne Verheij, Amsterdam UMC за хистологичен анализ на панкреасна тъкан, Neil Gottel и Elle Hill, University of Chicago, за изолиране на ДНК и подготовка на библиотеки, Cindy Bethal, University of Chicago за бактериология, Mark Davids и Floor Hugenholtz, Amsterdam UMC за помощ с анализа на микробиотата.