Корейски институт за изследване на храните

Корейски институт за изследвания на храните, Биотехнология на храните, Университет за наука и технологии

Корейски институт за изследване на храните

Корейски институт за изследване на храните

Корейски институт за изследвания на храните, Биотехнология на храните, Университет за наука и технологии

2018 том 24 брой 5 страници 943-947

  • Публикувано: 2018 г. Получено: 07 ноември 2017 г. Издадено на J-STAGE: 27 октомври 2018 г. Прието: 20 юни 2018 г. [Предварителна публикация] Издадено: - Преработено: -

(съвместим с EndNote, Reference Manager, ProCite, RefWorks)

(съвместим с BibDesk, LaTeX)

Тирозолът (2- (4-хидроксифенил) етанол) е фенилетаноид, присъстващ в зехтина, с антиоксидативен, противовъзпалителен и цереброневрален защитен ефект. В това проучване защитният ефект на тирозола срещу окислително увреждане е измерен в мускулните клетки L6. Тирозолът ефективно инхибира индуцираната от H2O2 L6 клетъчна смърт отчасти чрез регулиране на ERK, JNK и p38 MAP киназа и повишено производство на АТФ. В допълнение, той увеличава експресията на HO-1 в клетката. Въз основа на резултатите, тирозолът е ефективен при инхибиране на окислителното увреждане на мускулните клетки.

"data-html =" true "data-Position =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Ji, 1996). Реактивните кислородни видове е термин за химически реактивни молекули, съдържащи кислород като супер-оксиден радикал, хидроксилен радикал, водороден пероксид (H2O2) и синглетен кислород, произвеждан по време на нормалните метаболитни процеси и играе ключови физиологични роли в организма. нуклеинови киселини в клетката (Djordjevi, VB (2004). Свободните радикали в клетъчната биология. Международна Преп. Цитол., 237, 57-89.

"data-html =" true "data-position =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Djordjevi, 2004). Човешкото тяло е защитено чрез производство на антиоксидантни ензими като защитна система срещу подобни окислителни щети, но защитната способност варира значително в зависимост от възрастта и здравословното състояние (Irshad, M. и Chaudhuri, PS (2002). Оксидантно-антиоксидантна система: роля и значение в човешкото тяло. Индийски J. Exp. Biol., 40, 1233-1239.

Като фенилетаноид, присъстващ в зехтина, тирозол (фиг. 1. Химична структура на тирозола

"data-html =" true "data-position =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Bu и др., 2007). Не са провеждани обаче проучвания за защитен ефект срещу окислително увреждане в мускулните клетки. В това проучване защитният ефект на тирозола срещу увредено от реактивен кислород увреждане е изследван в L6 мускулни клетки чрез измерване на ефекта върху жизнеспособността на клетките след третиране с H2O2. Също така бяха измерени ефектите върху сигналния път на митоген-активирана протеин киназа (MAPK) и вътреклетъчното производство на HO-1.

ефекти

Химична структура на тирозола

Материали Тирозолът е закупен от Chromadex (Irvine, САЩ). Модификацията на Dulbecco на среда Eagle (DMEM), фетален говежди серум (FBS) и антибиотични антибиотици (AA) са закупени от Gibco-BRL (Gaithersburg, USA). HO-1 антитяло е закупено от Enzo Life Science (Farmingdale, САЩ). Разцепена каспаза-3, p44/42 MAPK (Erk1/2), фосфо-p44/42 MAPK (Erk1/2), p38 MAPK, анти-фосфо-p38 MAPK, анти-JNK, анти-фосфо-JNK и антитела към тубулин са закупени от Cell Signaling Technology (Danvers, САЩ)

Клетъчна култура L6 мускулна клетъчна линия е получена от Korean Cell Line Bank (Сеул, Корея). Клетките се култивират при 37 ° С, 5% СО2, използвайки DMEM, съдържащ 10% FBS и 1% АА.

L6 клетки се посяват при 1 х 105 клетки/ml в 96-ямкова плака и се инкубират. След като клетките достигнат сливане, средата беше променена на DMEM, съдържаща 2% конски серум и 1% AA за диференциация в миотръби. Експерименти бяха предприети след диференциация.

Жизнеспособност на клетките Клетъчната жизнеспособност се измерва чрез анализ на МТТ [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолиев бромид]. За да се измери защитният ефект на тирозола в мускулните клетки, култивираните клетки се третират с всяка концентрация на тирозол и 0,5 тМ Н2О2 едновременно и се инкубират отново в продължение на 24 часа. Клетките се оцветяват с разтвор на МТТ (0,5 mg/ml в PBS) и абсорбцията се измерва при 540 nm. Защитният ефект на тирозола е изразен като процент (%) чрез изчисляване на скоростта на възстановяване с тирозол лечение на клетъчната смъртност с третиране с H2O2.

Западна имуноблотинг Впоследствие се събират клетки и се добавя лизисен буфер (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,02% натриев азид, 10 ug/ml PMSF, 1 ug/ml апротинин) и сместа, обработена с ултразвук за извличане на протеини вътре в клетките. След клетъчен лизис, протеините се разделят, използвайки 10% SDS-поли-акриламиден гел електрофореза и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана Hybond ECL. Мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено мляко и инкубирани с различни първични антитела: анти-разцепена каспаза-3 (разреждане 1: 2000), анти-p44/42 MAPK (Erk1/2) (1: 2000 разреждане), анти-фосфо -p44/42 MAPK (Erk1/2) (разреждане 1: 2000), анти-p38 MAPK (разреждане 1: 1000), анти-фосфо-p38 MAPK (разреждане 1: 2000), анти-JNK (разреждане 1: 2000), анти-фосфо-JNK (разреждане 1: 1 000) или анти-HO-1 (разреждане 1: 2 000), последвано от конюгирано анти-заешко или мише вторично антитяло от хрян (HRP). Мембраните бяха разработени с помощта на засилено откриване на хемилуминесценция (Bio-Rad, Hercules, USA). Интензитетите на лентите бяха анализирани с помощта на Bio-Rad Image Lab Software.

Производство на аденозин трифосфат (АТФ) Производството на АТР в L6 клетки беше измерено с помощта на комплект за анализ на биолуминесценция на АТР HS II (Roche, Германия). Култивираните клетки се третират едновременно с всяка концентрация на тирозол и 0,5 тМ Н202 и се инкубират отново в продължение на 24 часа. Клетките се лизират и се провежда анализ на биолуминесценция на АТР. Абсорбцията е измерена с помощта на луминометър (Tecan, Швейцария).

Статистически анализ Резултатите бяха изразени като средно ± стандартно отклонение и статистическата значимост беше анализирана с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от Tukey's post hoc тест. P-стойности под 0,05 са статистически значими.

Защитни ефекти в мускулните клетки Силните упражнения произвеждат прекомерно активни кислородни видове, причинявайки оксидативно увреждане на мускулните тъкани (Morales-Alamo, D. и Calbet, J.A. (2014). Свободните радикали и спринтните упражнения при хората. Безплатен Радич. Рез., 48, 30-42.

"data-html =" true "data-position =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Morales-Alamo и Calbet, 2014 г.) Защитен ефект на тирозола срещу H2O2-индуцирано окислително увреждане е измерено в L6 мускулни клетки, за да се определи защитен ефект на мускулните клетки. След потвърждаване на L6 клетъчната смърт не е индуцирана от 100 µM тирозол, L6 клетки са третирани с 1, 30 и 100 µM проби от тирозол с 0,5 mM H2O2 в продължение на 24 часа. В резултат това измерва жизнеспособността на клетките, L6 клетки, третирани с H2O2, разкриват 43,2% от жизнеспособността на клетките, но лечението с тирозол намалява клетъчната смърт по зависим от концентрацията начин (Фиг. 2. Защитни ефекти на тирозола срещу H2O2-индуцирано окислително увреждане в L6 мускулни клетки. L6 клетки се третират с 0,5 mM H2O2 и тирозол за 24 часа. Данните представляват средната стойност ± SE от три експеримента. *стр Фиг. 2). Инхибиторният ефект на тирозола върху L6 клетъчната смърт е съответно 22,3, 33,1 и 58,3% при 1, 30 и 100 цМ. Изображенията на L6 клетки са показани на фиг. 3. Микроскопични изображения на L6 клетки. (А) Нормално. (Б) Диференциация. (С) H2O2. (D) H2O2 + 100 цМ тирозол. L6 клетките се третират с 0,5 тМ Н202 и тирозол в продължение на 24 часа. Скала = 100 µm.

Защитни ефекти на тирозола срещу H2O2-индуцирано окислително увреждане в L6 мускулни клетки. L6 клетките се третират с 0,5 тМ Н202 и тирозол в продължение на 24 часа. Данните представляват средната стойност ± S.E. от три експеримента. *стр

Микроскопски изображения на L6 клетки. (А) Нормално. (Б) Диференциация. (С) H2O2. (D) H2O2 + 100 цМ тирозол. L6 клетките се третират с 0,5 тМ Н202 и тирозол в продължение на 24 часа. Скала = 100 µm.

Ефект на тирозола върху H2O2-индуцираната активация на каспаза-3 в мускулните клетки Каспаза-3, зависима от цистеин аспартатна протеаза, е ключов регулатор на клетъчната смърт (Nicholson, D.W. (1999). Структура на каспаза, протеолитични субстрати и функция по време на апоптотична клетъчна смърт. Клетъчната смърт се различава., 6, 1028-1042.

Ефекти на тирозола върху разцепеното ниво на каспаза-3 в L6 клетки.

(А) Западен имуноблотинг анализ на разцепена каспаза-3 в L6 клетъчен лизат. Като контрол на натоварването се използва тубулин. (Б) Количествено определяне на западната имуноблотинг. L6 клетките се третират с 0.5 mM H2O2 и тирозол в продължение на 24 часа. Данните представляват средната стойност ± S.E. от три експеримента. ***стр

Ефект на тирозола върху активирано от H2O2 ERK1/2, p38 MAPK и JNK 1/2 активиране в мускулните клетки Проучихме дали сигналният път на MAPK, включително екстра клетъчна сигнално-регулирана киназа (ERK), p38 MAP киназа (p38 MAPK) и c-Jun N-терминална киназа (JNK), участва в защитни ефекти на тирозол срещу H2O2-индуциран клетъчна смърт, тъй като многобройни проучвания предполагат, че ROS може да активира MAPK сигнален път (McCubrey, JA, Lahair, MM, и Franklin, RA (2006). Активиране на реактивни кислородни видове, активирани на MAP киназните сигнални пътища. Антиоксид. Редокс сигнал, 8, 1775-1789.

Ефекти на тирозола върху MAPK фосфорилиране в третирани с H2O2 L6 клетки.

(А) Western имуноблотинг анализ с посочени антитела в L6 клетъчен лизат. Като контрол на натоварването се използва тубулин. (B – D) Количествено определяне на Western имуноблотинг. L6 клетките се третират с 0.5 mM H2O2 и тирозол в продължение на 24 часа. Данните представляват средната стойност ± S.E. от четири експеримента. *стр

Ефекти на тирозола върху производството на АТФ.

След като L6 клетките бяха изложени на H2O2 в присъствието или отсъствието на тирозол в продължение на 24 часа, се определяше съдържанието на АТР. Данните представляват средната стойност ± S.E. от три експеримента. *стр

"data-html =" true "data-position =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Ogborne и др., 2004). Повишената експресия на HO-1 е свързана с намалена ROS и поддържане на вътреклетъчните условия. В това проучване, измерването на HO-1 се измерва, използвайки Western имуноблотинг, за да се оцени ефектът на тирозола върху експресията на HO-1 като представляващ фактор на антиоксидационния механизъм. В резултат на това експресията на вътреклетъчен HO-1 протеин се увеличава в сравнение с контролата, когато се третира с тирозол (Фиг. 7. Ефекти на тирозола върху експресията на HO-1 протеин в L6 клетки. (A) Western имуноблотинг анализ. (B) Количествено определяне на западната имуноблотинг. Данните представляват средната стойност ± SE от три експеримента. ***стр Фиг. 7).

Ефекти на тирозола върху експресията на HO-1 протеин в L6 клетки.

(А) Западен имуноблотинг анализ. (Б) Количествено определяне на западната имуноблотинг. Данните представляват средната стойност ± S.E. от три експеримента. ***стр

"data-html =" true "data-position =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Xie и др., 2017). В това проучване ние изследвахме антиоксидантните свойства на тирозола, използвайки оксидативен стрес в мускулните клетки L6. Многобройни проучвания са използвали H2O2 (един от основните агенти, генерирани от оксидативен стрес), за да предизвикат клетъчно увреждане, съответно ние също използваме H2O2 като индуктор на оксидативен стрес.

В това проучване тирозолът значително инхибира индуцираната от оксидативния стрес клетъчна смърт чрез намаляване на JNK фосфорилирането и повишена експресия на протеин HO-1 в мускулни клетки L6. Следователно тирозолът има значителен потенциал като вещество, което инхибира мускулните увреждания от оксидативен стрес, предизвикан от тежки упражнения.

Признание Това проучване е подкрепено от Корейския институт за изследване на храните (E0186701).