Резюме

Затлъстяването е често съпътстващо заболяване за белодробна артериална хипертония (БАХ). Освен това естрогенът и неговите метаболити са рискови фактори за развитието на БАУ. Висцералната мастна тъкан (ДДС) е основно място за производство на естроген; обаче влиянието на индуцираните от затлъстяването промени в синтеза и метаболизма на естрогена върху развитието на PAH е неясно. За да се справим с това, ние изследвахме ефектите от инхибирането на синтеза и метаболизма на естрогена върху развитието на белодробна хипертония при мъжки и женски мишки със затлъстяване.

метаболизма

Изчерпахме ендогенния естроген при лептин-дефицитни (ob/ob) мишки с естрогенен инхибитор анастрозол (ANA) и определихме ефектите върху развитието на белодробна хипертония, плазмен естрадиол и 16α-хидроксиестрон в урината (16αOHE1). Метаболизмът на естрогена чрез цитохром P450 1B1 (CYP1B1) се инхибира с 2,2 ′, 4,6′-тетраметоксистилбен (TMS).

ob/ob мишки спонтанно развиват белодробна хипертония, белодробно съдово ремоделиране и повишено производство на реактивни кислородни видове в белия дроб; тези ефекти са отслабени от ANA. Нивата на естрадиол са намалени при затлъстели мъжки мишки; обаче нивата на ДДС CYP1B1 и 16αOHE1 бяха увеличени. TMS също така отслабва белодробната хипертония при мъжки ob/ob мишки. Интраторакалната мастна тъкан от ob/ob мишки и обусловените от ДДС среди произвеждат 16αOHE1 и могат да допринесат за оксидативен стрес, ефекти, които се отслабват както от ANA, така и от TMS.

Затлъстяването може да предизвика белодробна хипертония и промени в метаболизма на естрогена, което води до повишено производство на 16αOHE1 от ДДС, което допринася за оксидативен стрес. Понастоящем естрогенните инхибитори са в клинични изпитвания за БАХ. Това проучване има транслационни последици, тъй като предполага, че естрогенните инхибитори могат да бъдат особено полезни при лечението на затлъстели лица с ПАХ.

Резюме

Затлъстяването е рисков фактор при пациенти с БАХ. Това проучване предполага, че това се дължи на променен метаболизъм на естрогена в мастната тъкан. Инхибирането на производството или метаболизма на естроген може да бъде от полза за пациентите със затлъстяване с БАХ. http://ow.ly/2zW830of1fG

Въведение

Затлъстяването е добре признат независим сърдечно-съдов рисков фактор и е съпътстващо заболяване на белодробната артериална хипертония (PAH) [1]. В регистъра REVEAL (Registry to EValuate Early and Long-term PAH disease management) 32% от пациентите с PAH са класифицирани като затлъстели при записване [2]. Този регистър отчита по-високо разпространение на лица с наднормено тегло и затлъстяване сред тези с идиопатична форма на БАХ [1]. Свързана със затлъстяването белодробна хипертония може да възникне в резултат на хиповентилация и хипоксия поради увеличеното механично натоварване на излишните телесни мазнини [3]. Въпреки това, метаболитните и възпалителни нарушения, които се появяват по време на затлъстяване, могат да играят роля в развитието на БАХ.

Мастната тъкан изразява високи нива на естроген-синтезиращия ензим ароматаза и при затлъстяване може да се превърне в основен източник на производство на естроген [4]. Интересното е, че мастната тъкан изразява високи нива на цитохром P450 1B1 (CYP1B1), ензим, участващ в метаболизма на естрогена [5]. CYP1B1 играе роля в клиничната PAH, като CYP1B1 е силно изразена в лезии на белодробна артерия на пациенти с PAH [6–8]. Освен това са идентифицирани CYP1B1 единични нуклеотидни полиморфизми, които имат значителна връзка с фракцията на изтласкване на дясната камера и метаболизма на естрогена [9]. Те са в неравновесие в тясна връзка с единични нуклеотидни полиморфизми, свързани с белодробна хипертония и онкогенеза [9].

Естрогенният метаболит 16α-хидроксиестрон (16αOHE1) се образува чрез CYP1B1 и е замесен в PAH. 16αOHE1 е мощен митоген в клетките на гладката мускулатура на белодробната артерия (PASMC), действащ по зависим от реактивен кислород вид (ROS) с малък ефект върху гладкомускулните клетки от системната циркулация [10]. Освен това, когато се прилага на мишки, 16αOHE1 води до развитие на фенотип на белодробна хипертония [8].

Нарастващите данни показват, че ендогенният естроген и неговите метаболити играят роля в развитието на БАХ. Високите нива на естрадиол (Е2) и ниските дехидроепиандростерон-сулфат (DHEA-S) са идентифицирани като рискови фактори за PAH при мъжете. Съвсем наскоро високите нива на E2 и ниските DHEA-S също се свързват с риска и тежестта на PAH при жени след менопаузата [11]. Клинично е показано, че E2 е свързан с PAH и корелира обратно с 6-минутно разстояние на ходене при мъже и жени след менопаузата [12]. В допълнение, анастрозолът (ANA) подобри 6-минутното разстояние на ходене в малко мащабно клинично изпитване на пациенти с ПАХ след менопауза [13].

Нашата хипотеза беше, че затлъстяването може да предизвика промени в метаболизма на естрогена и че това може да играе роля в развитието на белодробна хипертония при затлъстели мъже и жени. За да се характеризират ефектите на затлъстяването върху ендогенния естроген и неговия принос към PAH, ефектите на инхибитора на ароматазата, ANA и инхибитора на CYP1B1, 2,2 ′, 4,6′-тетраметоксистилбен (TMS), са изследвани при затлъстели мишки . Ние се съсредоточихме върху липсващия лептин ob/ob мишка, но също така проверихме наблюдения при мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD).

Материали и методи

Подробни описания са дадени в допълнителния материал.

ob/ob мишки

B6.V-Lep ob/Lep ob/OlaHsd (ob/ob) мишки на възраст 6–10 седмици и техните постни кученца (B6.V- (постно)/OlaHsd) са получени от Envigo (Huntingdon, UK).

HFD мишки

Мишките C57BL/6JOlaHsd на възраст 6-8 седмици (Envigo) бяха поддържани на нормална диета или HFD (процент калории от мазнини 42%, протеини 15%, въглехидрати 43%; Special Diet Services, Witham, UK) в продължение на 20 седмици. HFD мишките са натрупали 40% повече телесно тегло от нормалния си режим на диета (допълнителна фигура S1).

Хронични хипоксични изследвания

Развитието на белодробна хипертония при ob/ob и HFD мишки е постигнато с 14-дневна хипоксия, както е описано по-рано [14]. На мишките се прилага инхибитор на ароматазата ANA (3 mg · kg -1 ден дневно -1 за 14 дни) или носител (1% карбоксиметилцелулоза) дневно (интраперитонеално). Мишките, настанени в нормоксични условия, бяха изследвани като контроли.

Фармакологично инхибиране на CYP1B1 при мъжки ob/ob мишки

Мъжки ob/ob мишки и техните постни отпадъци са инжектирани с TMS, инхибитор на CYP1B1, 3 mg · kg -1 ден дневно -1 или носител (4% етанол), веднъж дневно в продължение на 14 дни (ip).

Измервания на хемодинамиката и дясната камера

Дяснокамерното систолично налягане (RVSP) и системното артериално налягане бяха измерени с помощта на PVR-1045 Millar катетър за налягане и проводимост (Millar Instruments, Houston, TX, USA). Дяснокамерната хипертрофия (RVH) беше оценена, както е описано по-рано [14].

Хистопатология на белия дроб

Белодробните сагитални участъци (5 μm) бяха оцветени с Elastin – Van Gieson. Белодробни артерии - 1 среда), събрани от мъжки ob/ob мишки за 24 h при 37 ° C в присъствието или отсъствието на ANA или TMS. Подредената с ДДС среда (VAT-CM) се разрежда преди употреба.

Оценка на клетъчната пролиферация

Разпространението беше оценено с помощта на брояч на клетки на Countess II FL (Life Technologies, Loughborough, UK), както е описано в допълнителния материал.

Имуноблотинг

Интересните протеини се оценяват чрез имуноблотинг на цели белодробни или mPASMC лизати, както е описано в допълнителния материал.

Количествена обратна транскриптаза-PCR

експресията на иРНК се оценява чрез количествена обратна транскриптаза-PCR, както е описано в допълнителния материал.

Amplex Red анализ

Водородният пероксид (H2O2) се оценява в mPASMC лизати, като се използва комплект за анализ на червен водороден пероксид/пероксидаза Amplex (Thermo Fischer Scientific, Loughborough, UK) в съответствие с инструкциите на производителя.

Оценка на окисляването на протеин тирозин фосфатаза

Накратко, необратимото окисление на протеинови тирозин фосфатази (PTPs) беше оценено чрез имуноблотинг, използвайки окислено PTP антитяло, което специфично разпознава сулфоновата киселина под формата на PTP цистеинови остатъци.

Определяне на ROS в белодробни секции чрез имунофлуоресценция

Имунохистохимията на ROS маркера 8-хидроксигуанозин (8-OHG) се определя в цели белодробни секции, както е описано по-горе [10].

Анализ на данни

Ефекти на затлъстяването върху циркулиращия естрадиол (Е2) и експресията на висцерална мастна тъкан (VAT) на цитохром P450 1B1 (CYP1B1). ANA: анастрозол; GAPDH: глицералдехид фосфат дехидрогеназа. а, б) Циркулиращи плазмени нива на Е2 в а) нормоксични и хипоксични слаби и ob/ob мъжки мишки (n = 5–10 на група) и b) нормоксични и хипоксични слаби и ob/ob женски мишки (n = 4–7 на група), третирани със или без ANA 3 mg · kg -1 ден дневно -1. c, г) Представителен имуноблот и количествено определяне на експресията на протеин CYP1B1 в ДДС от в) мъжки и г) женски слаби и ob/ob мишки (n = 3-4 на група). Данните са представени като средно ± sem. *: p -1) [15, 16]. Освен това об/женските жени са безплодни и имат значително по-ниско тегло на матката (допълнителна фигура S9a). Теглото на матката не се влияе от HFD, но се намалява от ANA (допълнителна фигура S9b).

Нивата на тестостерон също са оценени при мъжки ob/ob и HFD мишки. Не са наблюдавани значителни разлики в тестостерона между об/об и HFD изследователски групи (допълнителни фигури S9c и d).

Не успяхме да открием DHEA-S в плазмени проби от изследваните мишки (данните не са показани).

CYP1B1 и 16αOHE1 са повишени при затлъстели мъжки мишки

Експресията на CYP1B1 беше повишена в ДДС от мъжки и женски ob/ob мишки в сравнение с техните слаби контроли (фигура 3в и d). В съответствие с това наблюдение, нивата на 16αOHE1 в урината бяха повишени при мъжки нормоксични ob/ob мишки (фигура 4а). В мъжките проучвани групи хипоксията води до увеличаване на 16αOHE1 в урината при слаби животни, което не е засегнато от лечението с ANA. Въпреки това, ANA увеличава урината 16αOHE1 при хипоксични мъже ob/ob (фигура 4а). Не са наблюдавани промени в 16αOHE1 при женски ob/ob животни при нормоксични условия. В женските хипоксични проучвателни групи хипоксията води до увеличаване на 16αOHE1 и това се смекчава чрез лечение с ANA при слаби мишки, докато ANA увеличава 16αOHE1 при ob/ob мишки (фигура 4b).

Нива на 16α-хидроксиестрон (16αOHE1) и ефектите на инхибирането на цитохром P450 1B1 (CYP1B1) при затлъстели мишки. ANA: анастрозол; RVSP: систолично налягане в дясната камера. a, b) Нива на 16αOHE1 в урината при а) мъжки и b) женски ob/ob мишки, лекувани със и без ANA 3 mg · kg −1 · ден −1 в продължение на 14 дни при нормоксични и хипоксични условия (n = 4-8 на група ). c, d) Ефектите от инхибирането на CYP1B1 с TMS 3 mg · kg −1 · ден −1 за 14 дни в c) RVSP (n = 5-7 на група) и d) процент на ремоделирани белодробни артерии (n = 5 на група) при мъжки нормоксични слаби и ob/ob мишки. Данните са представени като средно ± sem. *: p −1 16αOHE1 (n = 5).

Ефекти на VAT-CM върху разпространението на mPASMC и оксидативен стрес

За да се изследва по-нататък ролята на CYP1B1 в мъжки ob/ob мишки, среда за клетъчна култура се инкубира с ДДС, събрана от мъжки ob/ob мишки. Анализът на ДДС-CM разкри, че той съдържа значително по-ниски нива на Е2 в сравнение с контролната среда (фигура 5а). Предварителното лечение с ANA не е оказало ефект върху това, но TMS е довело до значително увеличение на нивата на Е2 (фигура 5а). Обратно, VAT-CM съдържа значително по-високи нива на 16αOHE1 в сравнение с контролната среда и това се отслабва както от ANA, така и от TMS (фигура 5b). Стимулирането на mPASMCs с VAT-CM повишава експресията на пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA) (фигура 5в) и води до клетъчна пролиферация. Пролиферативните ефекти на VAT-CM, приготвени в присъствието на ANA или TMS, бяха значително намалени (фигура 5г).

ob/ob мъжки мишки демонстрират завишени от Е2 повишения на RVSP и това е придружено от повишена експресия на ароматаза в мастната тъкан. Налице е обаче намаляване на циркулиращия Е2. Тъй като има повишена експресия на CYP1B1 в ДДС, това предполага, че може да има повишен метаболизъм на Е2 и в съответствие с това има увеличение на 16αOHE1 в урината. Инхибирането на CYP1B1 с TMS също обърна предизвиканото от затлъстяването увеличение на RVSP при мъжете. Това е обобщено на фигура 9. При хипоксия има също завишени от Е2 повишения на RVSP и съдово ремоделиране.

Тъй като затлъстяването при мъжки мишки може да бъде уникално предизвикано от метаболизма на E2, индуциран от CYP1B1, ние се фокусирахме върху мъжете ob/ob, за да проучим това допълнително. В обобщение демонстрирахме, че ДДС от мъжки ob/ob мишки преобразува E2 в 16αOHE1 чрез CYP1B1. Този 16αOHE1 се произвежда в достатъчно количество, за да предизвика CYP1B1-зависима пролиферация на PASMCs. Тази пролиферация е най-голяма при ob/ob мишки и зависи от ROS. In vivo, ROS белодробната продукция при мъжки ob/ob мишки зависи от ендогенен Е2, както и индуцираната от хипоксия ROS. Това е обобщено на фигура 9.

Резултатите обаче предполагат тясна връзка между експресията на CYP1B1 в мастната тъкан, развитието на белодробна хипертония и ефективността на ANA при нормоксични ob/ob мъжки мишки. В действителност, инкубацията на PASMCs с VAT-CM води до генериране на ROS, окислително увреждане и активиране на клетъчните пътища за оцеляване, което води до тяхното разпространение по редокс-чувствителен начин, подобен на този, наблюдаван само при 16αOHE1. Тези ефекти се отслабват както от ароматазата, така и от инхибирането на CYP1B1. В съответствие с тази констатация се наблюдава увеличаване на 8-OHG оцветяването, маркер за производството на ROS, в цялата белодробна тъкан от ob/ob мишки. Лечението с ANA значително отслабва този феномен при мъжки и женски мишки в нормоксия, но е ефективен само при мъжки хипоксични мишки, като отново подчертава сексуалния диморфизъм в механизмите, подкрепящи развитието на белодробната хипертония. Не са наблюдавани значителни промени в антиоксидантните ензими SOD1 или каталазата в белодробната тъкан на изследваните мишки; въпреки това, NADPH оксидазата 4 е увеличена при мъжки ob/ob мишки в хипоксия и това е отслабено от ANA. Тези открития показват, че при затлъстяване се наблюдава увеличаване на производството на ROS, а не намаляване на нивата на антиоксиданти и че ANA има антиоксидантни свойства.

Известно е също така, че 16αOHE1 насърчава инсулиновата резистентност и други метаболитни нарушения, а ob/ob мишките, използвани в това проучване, наистина са непоносими към глюкоза. Следователно е възможно инсулиновата резистентност да играе роля в наблюдавания фенотип, но това не е било конкретно оценено в предприетото проучване. Трябва да се отбележи, че преди това е показано, че ANA намалява метаболитните дефекти при миши модели на PAH [34]. Метаболитните дефекти все повече се свързват клинично с БАХ. Механизмите, лежащи в основата на това, остават неясни, въпреки че ROS са замесени [38]. Метформин е утвърдено лекарство за употреба при захарен диабет тип 2 и също е предложено като лечение на БАХ. По-рано показахме, че метформин може да инхибира експресията и активността на ароматазата за намаляване на естрогена и неговия метаболизъм при експериментална белодробна хипертония [7].

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Моля обърнете внимание: допълнителният материал не се редактира от редакцията и се качва така, както е предоставен от автора.