Резюме

Обективен

Това проучване има за цел да изследва ефекта и възможните механизми на затлъстяването, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, върху сперматогенезата при мъжки плъхове.

Методи

Общо 45 мъжки плъхове бяха разделени на случаен принцип в контролни (н = 15, нормална диета) и групи със затлъстяване (н = 30, диета с високо съдържание на мазнини) и са били хранени в продължение на 16 седмици. Индексите на телесното тегло и органите се определят след умъртвяването. Измервани са показатели за репродуктивната функция, включително брой сперматозоиди, подвижност на сперматозоидите, апоптоза на сперматогенни клетки и нива на оксидативен стрес. Бяха анализирани и серумните метаболитни параметри и репродуктивните хормони.

Резултати

В сравнение с контролната група подвижността на сперматозоидите на епидидима при плъхове със затлъстяване е значително намалена (P 0,05).

Резултати

Хранителното затлъстяване може да увреди сперматогенезата при мъжки плъхове поради дългосрочни ефекти върху сперматогенезата.

Заден план

Затлъстяването се отнася до прекомерно натрупване на телесни мазнини, което има отрицателно въздействие върху здравето. Според Световната здравна организация (СЗО) индексът на телесна маса (ИТМ) от 25–29,9 kg/m 2 се определя като наднормено тегло, докато BMI от 30 kg/m 2 се определя като затлъстяване. Честотата на наднорменото тегло и затлъстяването рязко се е увеличила [1]. Съответните статистически данни показват, че популацията със затлъстяване се е удвоила в световен мащаб от 1980 до 2008 г. и повече от 10% от населението е със затлъстяване [2]. Разпространението на затлъстяването продължава да нараства според последващи проучвания, като най-новата оценка показва, че 35,2% от мъжете и 40,4% от жените са със затлъстяване [3].

Затлъстяването е добре документирано, че е свързано със заболявания като захарен диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания, рак и синдром на сънна апнея [4, 5]. Напоследък ефектът от затлъстяването върху плодовитостта е широко проучен. Настоящите проучвания обаче основно се фокусират върху ефектите на затлъстяването върху репродуктивната функция на женските или женските животни, докато мъжките или мъжките животни са слабо проучени [6]. Освен това, докато повечето доклади са изследвали затлъстяването във връзка с репродуктивната функция, основните механизми не са изяснени [7, 8]. В допълнение, заключенията за ефектите от затлъстяването върху параметрите на спермата и репродуктивните хормони се различават [9] поради многото фактори, които могат да повлияят на мъжката плодовитост. Например, мета-анализ, извършен от MacDonald et al. не установи статистически значима връзка между ИТМ и параметрите на спермата [10], докато проучване, проведено от Sermondade et al. установи значителна J-образна връзка между ИТМ и абнормен брой сперматозоиди [11]. Това проучване има за цел да изследва сперматогенезата при мъжки плъхове със затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, за да сведе до минимум експерименталните пристрастия и да идентифицира възможните механизми.

Методи

Животни

Шестседмични мъжки плъхове Sprague-Dawley са осигурени от Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай). Плъховете са имали телесно тегло 130,43 ± 7,15 g. Те се поддържаха по 12-часов дневен/12-часов нощен график (светлините светват от 19:00 до 07:00 часа). Температурата и влажността се поддържат съответно 22 ± 1 ° C и 60%. Храната и водата се предоставят ad libitum и всяка клетка съдържа 5 плъха. Постарахме се по най-добрия начин да сведем до минимум страданието на животните и за евтаназия се използва вдишване на CO2.

Експериментален дизайн

Общо 45 мъжки плъхове са включени в това проучване и са разделени на случаен принцип в две групи, а именно контролната група (н = 15, нормална диета) и групата за затлъстяване (н = 30, диета с високо съдържание на мазнини), която е получила съответно нормална диета и диета с високо съдържание на мазнини. Формулата с високо съдържание на мазнини беше, както следва [12]: 10% масло от свинска мас, 10% захароза, 1,5% холестерол, 0,5% жлъчна сол, 5% жълтък на прах и 73% нормална храна. Теглото на тялото и дължината на плъховете се измерват всяка седмица в продължение на 16 последователни седмици. На 16-та седмица плъховете в долните квартили за наддаване на тегло (н = 8) са изключени от групата на затлъстяването. Тъй като плъховете с телесно тегло в долния квартил имат тенденция да показват устойчивост на затлъстяване, те също бяха изключени и в крайна сметка бяха анализирани 22 затлъстели плъха. За да се осигури подходящо групиране, беше направено сравнение на общото състояние между двете групи. Общият статус на растеж и метаболитните параметри на двете групи бяха сравнени в края на 16-та седмица.

След хранене със съответните диети в продължение на 16 седмици, всички плъхове се упояват с CO2. Взети са кръвни проби от коремната аорта, центрофугирани (2400 rpm за 20 минути при 4 ° C и замразени при - 70 ° C) и са използвани за измерване на нивата на серумните хормони [лутеинизиращ хормон (LH), общ тестостерон TT), естрадиол ( Е2) и глобулин, свързващ половите хормони (SHBG)]. Анализирани са хистология на тестисите, апоптоза на сперматогенни клетки и антиоксидантен статус на тъканите на тестисите. За определяне на броя и подвижността на сперматозоидите са използвани суспензии на сперматозоиди от епидидима на опашката.

Оценки на телесния индекс и органния индекс

Бяха получени и претеглени двустранни тестиси, двустранни епидидимиди и висцерална мастна тъкан (обграждащи бъбреците, тестисите и omentum majus). Съответните параметри бяха определени, както следва: индекс на Ли = [тегло (g) × 10 3/дължина на тялото (cm)] 1/3; коефициент на мазнини = [тегло на висцералните мазнини (g) × 100%/телесно тегло (g)]; и коефициент на тестисите = [тегло на тестисите (g) × 100%/тегло (g)].

Серумни биохимични и хормонални анализи

SHBG в серума се определя с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), получен от Пекинския северен институт за биологични технологии (Пекин, Китай). LH, T и E2 в серума са измерени с радиоимуноанализи (RIA), като се използва комплект, получен от Пекинския северен институт за биологични технологии (Пекин, Китай). Тестостеронът без серум (FT) се изчислява, използвайки формулата на Vermeulen:

Хистологично изследване

Малки парченца тестис бяха фиксирани в разтвор на Bouin и 70% етанол, дехидратирани в градуиран етанол, фиксирани с 10% разтвор на формалин в продължение на 48 часа и обработени със смесена течност за обезкаляване. След дехидратация с алкохол главите на бедрената кост се вграждат с парафин, нарязват се на 5-μm участъци и се оцветяват с НЕ. Клетъчната морфология се наблюдава под светлинен микроскоп и се оценява с точкуване на Джонсен [13, 14]. Хистологичните критерии за модифицирана оценка на Джонсън са както следва: пълна сперматогенеза (резултат 10), леко нарушена сперматогенеза, много късни сперматиди, дезорганизиран епител (резултат 9), по-малко от пет сперматозоиди на тубула, малко късни сперматиди (оценка 8), без сперматозоиди, без късни сперматиди, много ранни сперматиди (резултат 7), без сперматозоиди, без късни сперматиди, малко ранни сперматиди (резултат 6), без сперматозоиди или сперматиди, много сперматоцити (резултат 5), без сперматозоиди или сперматиди, малко сперматоцити (резултат 4 ), само сперматогония (резултат 3), без зародишни клетки, само клетки на Сертоли (резултат 2) и без семенни епители (резултат 1).

Брой и подвижност на сперматозоидите

Получават се сперматозоиди от десния опашен епидидим с дължина 1,5 cm. Извършва се вътрешно изплакване с 1,0 ml модифицирана среда M199 при 37 ° С и пробите се инкубират за 30 минути във водна баня с температура 37 ° С с вибрации, за да се накара сперматозоидите да плуват. След това се екстрахира 15-μl суспензия на сперматозоиди за анализ на броя на сперматозоидите и анализ на подвижността с помощта на анализатор на сперматозоиди Hamilton-Thorne (HTM-IVOS). След това се изчислява броят на сперматозоидите на ml в суспензията от едностранен епидидим.

Оценка на апоптоза на сперматогенни клетки

Методът TUNEL се използва за маркиране на 3'-края на фрагментирана ДНК в апоптотичните сперматогенни клетки. Процедурата е извършена с помощта на химически метод за оцветяване на Roche’s TUNEL (Roche, SWISS, кат. № 11684817910) [15]. Кафяво-оранжевите частици в клетъчното ядро, наблюдавани под микроскоп, бяха класифицирани като апоптотични клетки. Индексът на апоптоза (AI) се определя по следния начин: 500 клетки са избрани от пет мощни полета от всяка секция и AI = номер на апоптотична клетка/500 × 100%.

Оценка на антиоксидантния статус

Комплектите за оценка на състоянието на антиоксидация на тестисите, включително концентрации на супероксиддисмутаза (SOD) [16] и малондиалдехид (MDA) [17], са закупени от Института по биоинженерия в Нанкин Джианчен (Нанкин, Китай). Тъканите на тестисите се изолират и се смачкват с течен азот, приготвя се хомогенат, а останалите процедури се извършват по протоколите на комплекта.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуерния пакет SPSS 13.0 (Чикаго, IL, САЩ). За сравняване на резултатите между двете групи бяха използвани t-тестове на Student или тестове на Mann-Whitney. Резултатите са представени като средната стойност ± s.e.m. във всички случаи и P

Резултати

Общ статус на растеж и метаболитни параметри

Резултатите показват, че в сравнение с тези в контролната група, индексът на Лий и нивото на коефициент на мазнини при хранителните плъхове със затлъстяване са значително увеличени (P Таблица 1 Общ статус на растеж и метаболитни параметри

Концентрация и подвижност на сперматозоидите

За да се изясни ефектът на затлъстяването върху броя и жизнеспособността на сперматозоидите, бяха открити концентрацията и подвижността на сперматозоидите. Концентрациите на сперматозоиди, извлечени от епидидима, са били 23,40 ± 9,72 × 10 6/ml и 24,64 ± 7,16 × 10 6/ml в двете групи, без значителна разлика (P > 0,05). Както е илюстрирано на фиг. 1, подвижността на сперматозоидите [(36,40 ± 9,17)% срещу (14,36 ± 7,67)%] е значително намалена в групата със затлъстяване в сравнение с контролната група (P Фиг. 1

уврежда

Резултати от хистологично изследване

За оценка на морфологията на сперматогенезата и сперматогенните клетки е извършено хистологично изследване. HE оцветяването демонстрира вакуолация в семенните тубули и структурна дисфункция в сперматогенните клетки или отделяне на зародишните клетки от базалната мембрана в групата за затлъстяване (фиг. 2а, б). Не е установена значителна разлика в резултатите на Джонсън [(9,14 ± 0,14) спрямо (8,86 ± 0,09)] (P > 0,05) между двете групи (фиг. 2в). Заключихме, че краткосрочното влияние на затлъстяването върху функцията на тестисите може да не е много очевидно; дългосрочните ефекти обаче могат да увредят сперматогенната функция.

За да се наблюдават ефектите от затлъстяването върху апоптозата на сперматогенни клетки, беше извършен TUNEL анализ. AI на сперматогенните клетки (фиг. 3а, б) е значително увеличен в групата със затлъстяване в сравнение с контролната група [(5,95 ± 0,49)% спрямо (8,61 ± 1,05)%] (P Фиг. 3

Анализи на репродуктивните хормони

По отношение на ефекта на затлъстяването върху мъжките репродуктивни хормони, серумните концентрации на cFT бяха намалени и серумните нива на SHBG бяха увеличени (P Таблица 2 Нива на репродуктивен хормон в двете групи

Оценка на оксидативния стрес

За да се определи ефектът на затлъстяването върху оксидативния стрес, бяха определени концентрациите на SOD и MDA в хомогената на тестисите. Концентрациите на SOD и MDA на тестикуларния хомогенат са [(64,8 ± 10,2) срещу (56,6 ± 14,4) U/ml] и [(3,0 ± 0,7) срещу (4,0 ± 0,8) nmol/ml] в двете групи (P > 0,05) и (P > 0,05), съответно (фиг. 4). Резултатите показват, че концентрацията на SOD намалява, докато концентрацията на MDA се увеличава; обаче нито една промяна не е статистически значима.

Дискусия

Затлъстяването е хронично метаболитно заболяване, причинено от взаимодействия на различни генетични и екологични фактори. Интересното е, че през последните 50 години, заедно с ежегодно нарастващата тенденция при затлъстяването при хората, плодовитостта показва паралелна тенденция на намаляване [18]. Няколко проучвания показват, че по-високият ИТМ е свързан със значително намаляване на концентрацията на сперматозоиди [19,20,21]. Изследователите са се опитали да разследват връзката между затлъстяването и намаляването на плодовитостта; консенсус обаче не е постигнат.

Понастоящем няма единен стандарт за оценка на затлъстели плъхове. През 1929 г. MO Lee [22] предлага индекса на Lee за оценка на затлъстяването при плъхове, което е най-често използваният метод за оценка на затлъстели плъхове. В диетен модел на затлъстяване, докладван от Levin, плъховете са станали устойчиви на затлъстяване с диети с високо съдържание на мазнини [23] и са открити разлики в техния метаболизъм в енергията, ендокринната, мастната и глутаминова киселина (GLU). Въз основа на съответната литература и индекса на Лий, една четвърт от плъховете в групата с високо съдържание на мазнини са били изключени в нашето проучване, тъй като са били устойчиви на затлъстяване. Останалите три четвърти от плъховете са класифицирани като група затлъстяване [24]. Нашите резултати демонстрираха успешно поколение на модела на затлъстели плъхове.

В момента ефектът на мъжкото затлъстяване върху броя на сперматозоидите, подвижността и морфологията при хората е спорен. Преглед установи, че до 2015 г. прогресивно намалена подвижност е докладвана в 13 от 35 статии, докато намален брой на сперматозоидите с нормална морфология е докладван само в 9 от 29 статии [6]. Въпреки това, два скорошни мета-анализа, включително 14 и 21 проучвания, показват повишен риск от азооспермия или олигозооспермия при мъже с наднормено тегло или затлъстяване [25, 26]. Резултатите от това проучване показват, че затлъстяването, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, може да промени хистоморфологията на семенните тубули, което може да няма незабавни ефекти върху фертилитета при мъжете веднага, но дългосрочните ефекти върху сперматогенезата, предизвикани от затлъстяването, могат да влошат фертилитета при мъжете.

Поради генните полиморфизми в популацията често се пренебрегват много фактори (напр. Тютюнопушене, консумация на алкохол и употреба на лекарства), които могат да повлияят на семенните параметри. Освен това пристрастията при подбора на проби могат да доведат до противоречиви заключения относно въздействието на затлъстяването върху спермата. Това проучване, чрез контролиране на различни объркващи фактори, разкрива, че затлъстяването намалява подвижността на сперматозоидите, без да променя броя на сперматозоидите, което е в съответствие с предишни доклади [25]. Възможният механизъм може да бъде увреждане на целостта на мембраните на сперматозоидите, ДНК на сперматозоидите и митохондриите на сперматозоидите, индуцирани от прекомерно активни кислородни видове (ROS) [27, 28].

Апоптозата е автономен програмиран процес на клетъчна смърт, който се стимулира при специфични условия и се регулира от различни гени. Установихме, че AI на сперматогенните клетки се е увеличил значително в групата на затлъстяването. Неотдавнашно проучване установи, че апоптозата на тестикуларните сперматогенни клетки е една от основните причини за мъжкото подплодие [29]. Клетъчната апоптоза се регулира предимно и се контролира от хомеостазата на Bax и Bcl-2. Когато съотношението Bcl-2/Bax се наруши, се активират сигналните пътища за каспаза надолу по веригата, което води до апоптоза. Съобщава се, че диета с високо съдържание на мазнини увеличава експресията на Bax и каспаза-3, но намалява експресията на Bcl-2 в тестисите [30]. Следователно, въз основа на нашите резултати, затлъстелите плъхове показват повишена сперматогенна клетъчна апоптоза поради дисбаланси на Bcl-2/Bax. Освен това затлъстяването е довело до метаболитни нарушения на липидите и хиперлипидемия, което може да увеличи стресовия отговор на ендоплазмения ретикулум. Следователно честотата на апоптоза на сперматогенни клетки се увеличава допълнително [31, 32] чрез повишена GRP78 иРНК и експресия на протеин.

SHBG е протеин за транспортиране на кръв за тестостерон и естрадиол. Синтезът и секрецията му се регулират от андроген и естроген. Серумният SHBG може да упражнява директни или индиректни ефекти върху преобразуването и метаболизма на андрогените и регулира хомеостазата на GLU и метаболизма на мастните киселини. В този експеримент нашите резултати потвърждават намаление на серумните нива на TT и cFT и повишаване на серумната концентрация на SHBG при затлъстели плъхове. Следователно ние предполагаме, че серумният SHBG е ключовият фактор за намаляване на серумните нива на cFT и плъховете със затлъстяване могат да развият лек първичен хипогонадизъм (намален серумен TT и cFT, повишен SHBG). Първичният хипогонадизъм при затлъстелите плъхове е вероятно иницииращият фактор за промени в оста на HPT.

Оксидативният стрес е силно корелиран с голямо разнообразие от възпалителни и метаболитни болестни състояния, включително затлъстяване. Оксидативният стрес е силно корелиран с кумулативно увреждане в организма, индуцирано от свободни радикали, които са неадекватно неутрализирани от антиоксиданти, а окислителното увреждане се влошава от намаляването на антиоксидантните ензимни активности, като тези на SOD, каталаза (CAT) и глутатион S-трансфераза (GST) [38]. Данните сочат, че има много източници на оксидативен стрес при затлъстяване [39]. В нашето проучване, за да се определи ефектът от затлъстяването върху оксидативния стрес, бяха определени концентрациите на SOD и MDA в тестисите хомогенат.

SOD, който предпазва клетките от увреждане на свободните радикали от ROS, е важен ензим, който предпазва от наранявания, причинени от вътрешни и външни супероксидни йони. MDA е алдехид, генериран в процеса на липидна пероксидация, причинена от свободните радикали. MDA показва увреждане на клетъчната мембрана и отразява тежестта на кислородната радикална атака върху реактивни клетки и нивата на метаболизма на свободните радикали in vivo. Намаленият SOD и повишеният MDA могат да предизвикат оксидативен стрес, причинявайки увреждане на клетките и дори смърт. Това проучване установи понижени нива на SOD и повишени нива на MDA в тестикуларните тъкани на плъхове със затлъстяване, демонстрирайки, че нивото на оксидативен стрес на тъканите на тестисите при затлъстели плъхове е повишено и може да повлияе на подвижността на сперматозоидите. Няколко възможни обяснения могат да обяснят тези констатации: затлъстяването е свързано с повишени серумни свободни мастни киселини, а ненаситените мастни киселини са податливи на атаки от ROS, произвеждайки пероксидация и в последствие водят до намалени нива на SOD и натрупване на MDA, което в крайна сметка се отразява от повишеното ниво на оксидативен стрес [40].

Заключение

Плъховете със затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, показват дисфункция на липидния метаболизъм и променени нива на репродуктивен хормон, както и повишени нива на оксидативен стрес в тъканите на тестисите, което води до лек първичен хипогонадизъм. Междувременно нормалната функция на оста HPT се поддържа в краткосрочен план чрез съответния механизъм за обратна връзка. Въпреки това, дългосрочните ефекти на затлъстяването могат да причинят спад на фертилитета при мъжете.