Редактиран от Стивън Д. Нимър, Център за рак на Мемориал Слоун Кетъринг, Ню Йорк, Ню Йорк, и приет от редакционната колегия на 15 септември 2008 г. (получено за преглед на 18 март 2008 г.)

домейна

Резюме

  • AML1-ETO
  • Левкемия
  • NHR4
  • СИН
  • t (8; 21)

Хромозомната транслокация е една от най-честите генетични аномалии при остра миелоидна левкемия (ОМЛ) (1). AML1-ETO е транскрипционен фактор на слетия протеин, генериран от t (8; 21) (q22; q22). Тази транслокация е идентифицирана в> 10% от всички случаи и до 40% от френско-американско-британския M2 подтип на AML (2–5). Въпреки това, експресията на AML1-ETO сама по себе си не успява да причини левкемия (6–11), което предполага изискването за „допълнителни посещения“ за AML1-ETO-положителните клетки да станат левкемогенни.

Преди това нашата група съобщи, че С-терминално пресечената форма на AML1-ETO (AML1-ETOtr) е силно левкемогенна (12). Интересното е, че кратка форма на AML1-ETO, AML1-ETO9a, която се получава чрез алтернативно сплайсинг, е идентифицирана в t (8; 21) проби от пациенти с левкемия и експресията на AML1-ETO9a индуцира бързо развитие на левкемия при мишки (13). AML1-ETOtr и AML1-ETO9a кодират съответно 556 и 575 aa (a.a.) и и в двата липсват регионите NHR3 и NHR4. Тези резултати предполагат, че N-терминалната част на ETO (NHR1 и NHR2), слята с AML1, е достатъчна, за да причини левкемия. В допълнение, С-крайните домейни на AML1-ETO (NHR3 и NHR4) всъщност могат да играят роля в потискането на развитието на заболяването.

В този доклад ние демонстрираме, че цинковата (Zn) -хелираща структура на NHR4 е отговорна за генериране на инхибиторни ефекти върху развитието на левкемия и че този регион взаимодейства със SON, потенциален ДНК/РНК-свързващ протеин, за да причини спиране на растежа в AML1-ETO-експресиращи клетки. Освен това демонстрираме решаваща роля на SON в клетъчната пролиферация и ненормална локализация на SON в проби от пациенти с левкемия, експресиращи AML1-ETO.

Резултати

Изтриване или нарушаване на Zn-хелатиращата структура на NHR4 домейна на AML1-ETO води до левкемогенеза.

Делецията на NHR4 домейна или точкова мутация на Zn-хелатиращия остатък на NHR4 домейна на AML1-ETO причинява бързо начало на левкемия. (А) Схематично представяне на AML1-ETO слет протеин и ретровирусната конструкция MigR1. В експериментите за ретровирусна инфекция и трансплантация са използвани три конструкции: AML-ETO с пълна дължина (MigR1-AE), AML1-ETO с изтрит домейн от NHR4 (MigR1-AE-ΔNHR4) и AML1-ETO със сериново заместване на цистеин a.a. 663 (MigR1-AE-C663S). (Б) Схематично представяне на Zn-хелатиращите структури в NHR4 на AML1-ETO. Един от Zn-хелатиращите остатъци, цистеинов остатък в позиция 663 (маркиран с кръг), беше избран за точкова мутация, която би нарушила Zn-хелатиращата структура на NHR4 домейн. (C) Криви на преживяване на Kaplan-Meier на мишки MF-1, трансплантирани с фетални чернодробни клетки, ретровирусно трансдуцирани с MigR1-AE, MigR1-AE-ΔNHR4 и MigR1-AE-C663S. (D) Проточно-цитометричен анализ на маркери за произход, изразен в EGFP-положителни (EGFP +) и EGFP-отрицателни (EGFP-) популации от периферна кръв от левкемични мишки с MigR1-AE-ΔNHR4. Числата във всеки квадрант представляват процента на клетките.

SON е протеин, взаимодействащ с NHR4.

Тъй като нашите експерименти за трансплантация по-горе показват, че NHR4 на AML1-ETO намалява ефекта на AML1-ETO върху левкемогенезата, ние предположихме, че NHR4 може да взаимодейства с протеини, които отменят способността на AML1-ETO да индуцира левкемия. За да търсим NHR4-взаимодействащи протеини, извършихме двухибриден скрининг на дрожди, като използвахме три примамки, включително ETO от див тип (ETO-wt), ETO с точкова мутация в NHR4 (ETO-C663S) и C-терминала регион на ETO (NHR3-NHR4) (фиг. 2А). Изолирахме един клон, който взаимодейства с ETO-wt и по-силно с NHR3-NHR4, но не и с ETO-C663S. Анализът на последователността разкри, че този клон съдържа 0,31 kb вмъкната cDNA, която кодира първите 102 a.a. на протеина SON на мишката (присъединяване към GenBank NM_178880). Съобщава се, че SON има ДНК-свързваща способност (16–18) и съдържа РНК-свързващи мотиви (19, 20) (подробности на фиг. S2), което предполага, че SON може да има двойна способност да взаимодейства както с ДНК, така и с РНК . Въпреки това не са провеждани задълбочени проучвания за функцията на SON.

GST експериментите с изтегляне показаха, че SON a.a 1–81 фрагмент, който е кодиран от екзони 1 и 2, е достатъчен за взаимодействие с ETO протеина (фиг. 2В). Освен това, в AML1-ETO-трансфектирани HeLa клетки, ендогенен SON се свързва с AML1-ETO с пълна дължина (фиг. S3). Взаимодействието между ендогенните протеини беше допълнително потвърдено в t (8; 21) левкемия, получена от пациент клетъчна линия, SKNO-1. Имунопреципитацията със SON антитяло изтегли AML1-ETO в SKNO-1 клетъчни лизати (Фиг. 2C), демонстрирайки, че SON е AML1-ETO взаимодействащ протеин.

Също така анализирахме клетъчната локализация на AML1-ETO и SON чрез имунофлуоресцентна микроскопия. Първо, изследвахме локализацията на ендогенния SON. SON, локализиран в ядрата в петнисто разпределение, изключен от DAPI-оцветения ДНК-богат регион (Фиг. S4). Тези резултати са в съответствие с предишни доклади, показващи локализация на SON в ядрените петънца, наречени интерхроматинови гранули (21). За да се определи дали SON колокализира с AML1-ETO, маркираният с HA AML1-ETO се трансфектира в клетки HeLa и клетките се имунизират с HA антитяло и SON антитяло. Установихме колокализация на ендогенен SON и маркиран с HA AML1-ETO (фиг. 2D), въпреки че не всички AML1-ETO бяха колокализирани със SON. Освен това е установено, че SON се колокализира с трансфектирания ETO протеин (фиг. 2D).

ETO-C663S мутация елиминира взаимодействието на SON, но не и взаимодействието на N-CoR.

Тъй като е известно, че NHR4 домейнът на ETO взаимодейства с N-CoR/SMRT, тествахме дали мутантът на цистеин 663 също е дефектен при свързване с N-CoR. SON N-терминален фрагмент (a.a. 1–81) и N-CoR фрагмент, съдържащ RIII домен (a.a. 975-1250) бяха трансфектирани с wt-ETO или ETO-C663S. Съобщава се, че PPPLIP последователността, присъстваща в RIII домейна на N-CoR, взаимодейства с региона, обхващащ NHR3 и NHR4 на ETO (14, 22). Въпреки това, не е ясно демонстрирано дали NHR4 сам по себе си взаимодейства с RIII домейн на N-CoR в клетки на бозайници. Интересното е, че ETO-C663S напълно загуби взаимодействието си с фрагмента SON, като същевременно запази способността си да взаимодейства с N-CoR RIII домейна (фиг. 3А).

Делецията на NHR4 или C663S мутация премахва взаимодействието SON, но не и взаимодействието N-CoR. (A) Ефекти от мутацията C663S върху взаимодействията с N-терминалния фрагмент SON и N-CoR фрагмента, съдържащ RIII домейна. GST-маркираният SON (1–81 aa) и HA-маркираният N-CoR (975–1250 aa) са трансфектирани в 293T клетки или с маркиран с флаг ETO от див тип (WT), или с ETO с мутация C663S, и имунопреципитирани с Flag антитяло. (B) Ефекти от NHR4 делеция или мутация C663S върху взаимодействията с SON и N-CoR в пълна дължина. SON антитяло или N-CoR антитяло е използвано за имунопреципитация за изтегляне на ендогенни SON или N-CoR и имуноблот за откриване на маркиран с флаг ETO; ETO от див тип (WT), ETO с мутация C663S (C663S) и ETO, изтрит от NHR4 (ΔNHR4).

За сравнение на ефекта на NHR4 мутацията върху взаимодействията с SON в пълна дължина и N-CoR с пълна дължина, ETO от див тип, ETO-C663S и ETO-ΔNHR4 бяха експресирани в 293T клетки, а антитялото SON или N-CoR антитялото се използва за имунопреципитация. Както SON, така и ETO от див тип бяха открити в комплекса, утаен със SON антитяло (Фиг. 3В). Въпреки това, нито ETO-C663, нито ETO-ΔNHR4 не са открити значително в имунопреципитатите (фиг. 3В). За разлика от това, взаимодействието на N-CoR не е повлияно от делеция или мутация на C663S в NHR4 областта на ETO (фиг. 3В). Вероятно взаимодействието на N-CoR все още се медиира от други домейни на ETO, докато SON взаимодействието абсолютно изисква Zn-хелатираща топология на ETO.

Нокдаун на SON от siRNA предизвиква значителен арест за растеж в клетките.

SON siRNA напълно събаря ендогенния SON и предизвиква спиране на растежа. (A) Нокдаун на SON от SON siRNAs в 293T клетки, потвърдени от Northern blotting. (B) Нокдаун на SON, потвърден от Western blotting. K562 клетки бяха трансфектирани с SON siRNA No. 1. Целоклетъчните лизати се приготвят след 3 дни и се имуноблотират със SON антитяло. (C) SON siRNA предизвиква спиране на растежа. Клетките K562 бяха трансфектирани с 1.3 μM siRNA с отрицателен контрол или три различни SON siRNA чрез нуклеофекция в 100 μl разтвор и клетките бяха преброени всеки ден. Графиката е представителна за четири експеримента. (D) Морфологични промени в клетки K562 3 дни след трансфекцията на SON siRNA (# 1).

Изразяване на фрагмента от N-терминала SON спасява арест на растеж, предизвикан от AML1-ETO.

Нокдаунът на SON само чрез siRNA води до спиране на растежа. Затова избрахме друг подход, за да блокираме взаимодействието между AML1-ETO и SON. Тъй като N-терминалната област на SON, съответстваща на a.a. 1–81 беше достатъчен за взаимодействие с NHR4 на AML1-ETO (фиг. 2В), ние свръхекспресирахме N-крайния фрагмент на SON, за да попречим на взаимодействието между AML1-ETO и ендогенния SON. За да осигурим правилната локализация на ядрената система, изразихме първите 140 г. на SON (SON-140), който има предполагаем сигнал за локализиране на ядрената система на a.a. 117–128 (въз основа на търсене в GenBank). Имунооцветяването разкрива, че SON-140 е перфектно колокализиран с ендогенен SON (Фиг. 5А). Експресията на този фрагмент SON-140 ефективно инхибира взаимодействието между AML1-ETO и ендогенния SON (Фиг. 5Б).

За да се провери дали експресията на SON N-терминалния фрагмент може да преодолее задържането на растеж, индуцирано от AML1-ET, клетките U937 с индуцируема експресия на AML1-ETO (23) бяха заразени с MigR1 (контролен вектор) или MigR1-Flag-SON-140. В присъствието на тетрациклин (без AML1-ETO) контролните клетки и клетките, експресиращи Flag-SON-140, показват идентичен растеж (фиг. 5С), потвърждавайки, че за разлика от SON siRNA, самият SON-140 не влияе на растежа на клетките. След това култивирахме тези две популации в отсъствието на тетрациклин, за да индуцираме експресия на AML1-ETO. Както беше съобщено по-рано, индуцирането на AML1-ETO в контролната линия на MigR1 предизвика спиране на растежа. Експресиращата линия Flag-SON-140 също претърпява спиране на растежа през първите 2-3 дни след отстраняването на тетрациклин, когато индуцираната експресия AML1-ETO надвишава експресията SON-140 (фиг. S5). Въпреки това, за разлика от контролните клетки на MigR1, тези клетки започнаха да се разширяват след 4-5 дни, когато индукцията на AML1-ETO е на умерено ниво (фиг. S5), и възстановиха нормален темп на растеж (фиг. 5С). Тези резултати показват, че инхибирането на взаимодействието между AML1-ETO и ендогенния SON може да спаси клетките от спиране на растежа, индуцирано от AML1-ETO, което предполага, че взаимодействието AML1-ETO и SON генерира отрицателни ефекти върху растежа на клетките.

Ненормално локализиране на SON в AML1-ETO-положителни клетъчни линии и t (8; 21) AML пациентски проби.

Ненормална цитоплазматична локализация на SON в t (8; 21) -положителни левкемични клетки. (A) Две левкемични клетъчни линии без t (8; 21), K562 и U937 и две t (8; 21) левкемични клетъчни линии, Kasumi-1 и SKNO-1, бяха оцветени с SON антитяло и DAPI (за ДНК) . (B) Кръвните клетки от четири различни пациенти с AML бяха оцветени със SON антитяло и DAPI и анализирани чрез флуоресцентна микроскопия. Пациент 1, FAB M2 подтип, не-t (8; 21); пациент 2, подтип FAB M4, не-t (8; 21); пациенти 3 и 4, FAB M2 подтип, t (8; 21) -положителен. Стрелките показват локализиран в цитоплазмата SON. Снимките са с представителни характеристики на всяка клетъчна линия и проби от пациенти от> 1000 клетки, анализирани с флуоресцентна микроскопия.

След това анализирахме SON локализация в първични AML клетки от пациенти. Левкемични взривове от кръвта на не-t (8; 21) пациенти с AML и t (8; 21) пациенти с AML бяха събрани и имунооцветени със SON антитяло. Поразително е, че t (8; 21) AML клетки показаха забележителна цитоплазматична локализация на SON (фиг. 6В), което е дори по-очевидно от наблюдаваното в t (8; 21) -положителни клетъчни линии. Приблизително 55 ± 7% от общото количество СОН се намира в цитоплазмата, въз основа на анализ на изображението. За разлика от това, не-t (8; 21) AML клетки не показват никакви SON протеини, присъстващи в цитоплазмата (фиг. 6В). Тези резултати категорично предполагат, че ненормалната цитоплазмена локализация на SON е свързана с t (8; 21) асоцииран AML.

Дискусия

Тъй като AML1-ETO с мутацията C663S, която специално нарушава взаимодействието със SON, е левкемогенна, а експресията на N-терминалния фрагмент на SON (SON-140), който се свързва с AML1-ETO, поддържа клетки, пролифериращи в присъствието на AML1- ETO, силно предсказуемо е, че експресията на AML1-ETO заедно със SON-140 ще бъде левкемогенна при мишки. Когато обаче експресията на AML1-ETO надвишава количеството на SON-140, клетките все още претърпяват спиране на растежа (фиг. S5), което предполага, че относителното количество на AML1-ETO и SON-140 би било важен фактор, който трябва да се има предвид при модела на мишката на съвместното изразяване на AML1-ETO и SON-140. В момента търсим метод за коекспресия на тези два протеина на правилното ниво в първичните хематопоетични клетки.

Интересно е да се определи точната локализация на цитоплазматичния SON. Проведохме експерименти, за да определим дали цитоплазменият SON в t (8; 21) -положителни клетки е локализиран в конкретни цитоплазмени органели, като ендоплазмен ретикулум (ER), Golgi и лизозоми/ендозоми. SON не се колокализира с нито една от тези органели (фиг. S8), което показва, че цитоплазматичният SON не присъства като компонент на ER, Golgi или лизозоми/ендозоми, а SON протеинът, открит в цитоплазмата, не просто представлява деградирала форма на СИН. Интересното е, че оцветяването на SON с маркер на Golgi, GM130, показа, че въпреки че изолираният SON протеин не е точно колокализиран с Golgi, той е в съседство с Golgi. Установихме, че N-терминалният фрагмент на SON (1–140 aa) е достатъчен за локализиране в ядрените петна (Фиг. 5А). Следователно е възможно протеинът SON, открит в цитоплазмата, да има мутации в N-терминалната област или да е изоформа, която не съдържа ядрени локализационни сигнали. Тъй като SON съдържа потенциални РНК-свързващи мотиви в своя С-терминален край, вероятно е SON да е свързан с РНК в цитоплазмата. Понастоящем се изследва функцията на ядрения/цитоплазмен SON.

Взети заедно, нашето проучване показва, че молекулярните събития, свързани с нарушаване на нормалната функция на NHR4, могат да бъдат вторична мутация, която си сътрудничи с AML1-ETO за насърчаване на левкемогенезата. Освен това идентифицирахме партньор SON, взаимодействащ с NHR4, протеин с потенциална ДНК-РНК способност за двойно свързване, осигуряващ връзката между SON и причиняващ болестта фактор. Взаимодействието между NHR4 на AML1-ETO и SON може да бъде един от факторите, генериращи инхибиторни ефекти върху развитието на левкемия чрез блокиране на клетъчната пролиферация. Аномалии на локализацията на SON в кръвните клетки от пациенти с t (8; 21) AML бяха демонстрирани за първи път в нашето проучване, което разкрива нова лекарствена цел за левкемия. По-нататъшни проучвания за изясняване на биологичната функция на SON могат да предоставят ценна информация за контрола на клетъчната трансформация и развитието на рак.

Методи

Клетъчни линии и проби за пациенти с AML.

Kasumi-1, SKNO-1, K562, U937 и U937T-AML1-ETO тет-индуцируеми клетъчни линии бяха отгледани в RPMI MEDIUM 1640 и 293T и HeLa клетки в модифицираната среда на Dulbecco Eagle, допълнена с 10% (обем/обем) FBS. Взети са кръвни проби от пациенти с новодиагностицирана ОМЛ в Университетската болница в Орхус (Орхус, Дания). Цялото вземане на проби е извършено като част от диагностичния процес и съгласно протоколи, одобрени от етичната комисия за окръг Орхус.

Изолация на фетални чернодробни клетки, ретровирусна трансдукция, трансплантация, хематологичен анализ и поточна цитометрия.

Феталните чернодробни клетки бяха събрани от миши ембриони E14.5 (MF-1), заразени с ретровируси, съдържащи MigR1 празен вектор, MigR1-AE-ΔNHR4 или MigR1-AE-C663S и трансплантирани в реципиентни мишки MF-1. Процедурите бяха извършени, както е описано по-рано (12, 13).

Трансфекция, инфекция и нуклеофекция.

Трансфекцията на 293T и HeLa клетка се извършва с помощта на Polyfect (Qiagen), както е описано по-горе (30). Инфекцията на клетките K562 и U937T се извършва, както е описано по-горе (31). Нуклеофекцията на клетки K562 се извършва съгласно протокола на производителя (Amaxa). Отрицателна контролна siRNA (каталог № 4621) и SON siRNA (каталог № 16708, siRNA ID номер 143161, 143162, 143163) са закупени от Ambion и трансфектирани в клетки с помощта на Lipofectamine 2000 (Invitrogen) за прилепващи клетки и нуклеофекция за суспензия клетки.

Хибриден скрининг за дрожди две.

Хибриден скрининг на дрожди е извършен от базираната на TetR двухибридна система (Proteinlinks Inc.), за да се скринира cDNA библиотека на мишата мултипотенциална хематопоетична прекурсорна клетъчна линия, EML (подарък от д-р Schickwann Tsai, Университет в Юта, Солт Лейк Град, Юта).

Производство на SON Antibody.

Поликлонално антитяло се произвежда при зайци за човешки SON a.a. 2090–2107 (EEKVAKKSGGATIEELTE) и пречистена чрез афинитетна хроматография (Open Biosystems).

Допълнителни детайли.

Допълнителна информация за експерименталните методи може да се намери в SI Methods.

Благодарности

Благодарни сме на д-р Н. Спек за нейните ценни предложения относно ръкописа. Благодарим на д-р. С. Хиберт (Университет Вандербилт) и Б. Майер (Университет Браун) за предоставяне на плазмиди, д-р С. Цай (Университет в Юта) за миша EML клетъчна линия cDNA библиотека и ДНК изследователски институт Kasusa, Кисаразу, Чика, Япония, за кДНК KIAA1019. Също така благодарим на д-р J. Biggs за критичното редактиране на ръкописа. Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Националните здравни институти CA096735 и CA104509 (за DEZ), от стипендия на Lady TATA Memorial Trust Award (към EYA) и от безвъзмездни средства от Датското общество за борба с рака и Датския съвет за медицински изследвания (за PH) . Това е ръкопис 18734 от Изследователския институт The Scripps.

Бележки под линия

    1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: d7zhangucsd.edu

Принос на автора: E.-Y.A., M.Y. и D.-E.Z. проектирани изследвания; E.-Y.A., M.Y., O.A.M., M.-C.L., A.B. и R.H. извършиха изследвания; H.B.O. и П.Х. допринесе нови реактиви/аналитични инструменти; E.-Y.A., M.Y. и D.-E.Z. анализирани данни; и E.-Y.A. и D.-E.Z. написа вестника.

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Тази статия е PNAS директно подаване. S.D.N. е гост-редактор, поканен от редакционния съвет.