1 Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж Chung-Ang, 102, Heukseok-ro, Dongjak-gu, Сеул 06973, Република Корея

мастна

2 Институт за биомедицински изследвания в Националната университетска болница в Сеул, 101, Daehak-ro, Jongno-gu, Сеул 03080, Република Корея

3 Предклиничен експериментален център, Сеулски национален университет, болница Bundang, 82, Gumi-ro 173 Beon-gil, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13620, Република Корея

4 Център за клинични изпитвания, болница Severance, здравна система на университета Йонсей, 50-1, Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Сеул 03722, Република Корея

5 Катедра по вътрешни болести, Медицински колеж в Сеул, 101, Daehak-ro, Jongno-gu, Сеул 03080, Република Корея

Резюме

1. Въведение

Безалкохолната мастна чернодробна болест или стеатохепатит (NAFLD/NASH) е мастно чернодробно заболяване, причинено от индуцирано затлъстяване. Неотдавнашно епидемиологично проучване съобщи, че разпространението на NAFLD е 25,24% в световен мащаб и 7,6% при деца [1]. Затлъстяването, захарният диабет тип 2 и дислипидемията са тясно свързани с NAFLD [2] и допринасят за прогресирането на заболяването до чернодробна фиброза и цироза [3]. Инсулиновата резистентност е добре признат рисков фактор за NAFLD [4]. Хиперинсулинемията в резултат на инсулинова резистентност увеличава не само синтеза на липиди, но и усвояването на мастни киселини от хепатоцитите поради повишената липолиза на адипоцитите [2]. Интервенция в начина на живот (диета и упражнения) и фармакологично лечение, като витамин Е, пиоглитазон и пентоксифилин, се използват за лечение на NAFLD [3].

Сред тези лекарства е показано, че пиоглитазон подобрява NAFLD в някои проучвания при хора [5, 6]. Пиоглитазон също намалява нивата на глюкоза на гладно и след хранене чрез подобряване на инсулиновата чувствителност при захарен диабет тип 2 [7] и в момента се използва като антидиабетно лекарство. Пиоглитазон действа чрез свързване с активирания от пероксизома пролифератор гама рецептор (PPARγ), член на суперсемейството на ядрените рецептори, който играе ключова роля в регулирането на глюкозата и метаболизма на липидите [8]. Пиоглитазон се метаболизира екстензивно чрез хидроксилиране и окисление в черния дроб, за да образува поне четири първични метаболита (M-I, M-II, M-IV и M-V) и два вторични метаболита (M-III и M-VI) [9]. Фармакологично активните M-IV и M-III са основните метаболити, открити в човешкия серум.

Пиоглитазон се метаболизира от множество ензими на цитохром P450 (CYP), главно CYP2C8, CYP3A4 и CYP2C9 [9, 10], които се регулират от ксенобиотичния рецепторен конститутивен андростанов рецептор (CAR) [11]. Предишни проучвания показват, че CAR може да причини разлики в ефикасността на лекарството, като променя степента на лекарствения метаболизъм. Например, метаболизиращият ензим ацетаминофен CYP1A2, CYP3A11 и глутатион С-трансферазата се активира по CAR-зависим начин след лечение с ацетаминофен при мишки от див тип и предизвиква хепатотоксичност, но не и при CAR нулеви мишки [12]. Следователно активността на CAR може да повлияе метаболизма на пиоглитазон и ефектите на пиоглитазон могат да варират в зависимост от степента на метаболизма.

Освен това активността на CAR влияе върху чернодробната стеатоза. Стимулирането на експресията на CAR от агонист на CAR (TCPOBOP) намалява стеатохепатита при мишки, хранени с диети с метионин холин [13]. CAR е член на подсемейство NR1; няколко други ядрени рецептори като прегнан Х рецептор; PPARα, β, γ; чернодробни Х рецептори α, β; и фарнезоиден X рецептор α също са членове на подсемейство NR1 и са свързани с патогенезата на NAFLD [14]. По този начин междуиндивидуалните различия в ефектите на пиоглитазон върху NAFLD могат да бъдат повлияни от активността на CAR и взаимодействията между няколко гена.

В това проучване предположихме, че ефектът на пиоглитазон върху NAFLD се влияе от активността на CAR. За да потвърдим тази хипотеза, ние изследвахме ефекта от делецията на CAR върху промените в NAFLD и свързаната с тях генна експресия, индуцирана от пиоглитазон в черния дроб на мишката.

2. Материал и методи

2.1. Животни и наркотични вещества

CAR +/+ (див тип, C57BL/6J) мишки бяха доставени от Orient Bio, Inc. (Seongnam, Корея). Мишки от див тип бяха разделени на две групи (контрол срещу активиране на CAR). За да се активира CAR активиране, веднъж седмично се прилага интраперитонеално инжектиране на 3 mg/kg TCPOBOP (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ). Хомозиготни CAR нокаутиращи мишки (CAR -/-) са генерирани чрез генно насочване, както е описано по-горе [15] и след това са кръстосани на мишки C57BL/6J до десетото поколение. Те бяха кръстосани на мишки CAR +/+ C57BL/6J (Orient Bio) и използвани като контроли. Мишките бяха настанени при стайна температура (23 ± 1 ° C), с 12: 12-часови цикли светлина-тъмнина и достъп до вода ad libitum.

При нормална диета с чау (облъчена с Purina лабораторна чау 38057, Пурина Корея, Сеул, Корея) и диета с високо съдържание на мазнини (60 kcal% мазнини, D12492, Research Diets, Inc., Ню Брунсуик, Ню Джърси), състояние на хранене, 8 –10-седмични мъжки CAR +/+ (контролирани и третирани с TCPOBOP) и CAR -/- мишки бяха разпределени в носители или третирани групи според приложението на пиоглитазон хидрохлорид (Takeda Chemical Industries, Осака, Япония). Пиоглитазон хидрохлорид се прилага по 10 mg/kg/ден по орален път, като се смесва с диетата в продължение на 12 седмици. Всяка експериментална група включва най-малко 4 мишки и експериментът се повтаря 3 пъти.

По време на прилагане на различни концентрации на пиоглитазон хидрохлорид (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта Круз, Калифорния, САЩ) на CAR +/+ и CAR -/- мишки (1, 3, 10, 20 или 30 mg/kg), пиоглитазон се прилага с помощта на sonde веднъж дневно в продължение на 14 дни. Пиоглитазон хидрохлорид се разтваря в Solutol HS-15 (9% във фосфатно буфериран физиологичен разтвор). Подобни серумни концентрации на пиоглитазон бяха открити, когато прилагахме различна концентрация на пиоглитазон на CAR +/+ мишки (10 и 20 mg/kg) и CAR -/- мишки (1 и 3 mg/kg).

За да открием краткосрочни промени в генната експресия след лечение с пиоглитазон, извършихме краткосрочен (6 часа) експеримент. Мишките бяха разделени на 4 групи CAR +/+ и CAR -/- мишки в зависимост от това дали е бил прилаган пиоглитазон и/или липид. Във всяка група бяха включени три мишки. Пиоглитазон хидрохлорид (20 mg/kg) и 3 g/kg 20% ​​интралипид (инжекция LIPO MCT, Dongkook Pharmaceutical Co., Chungbuk, Корея) са приложени чрез интраперитонеална инжекция.

Всички животни бяха умъртвени след гладуване в продължение на 6 часа, започвайки от 06:00 сутринта. Мишките бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на Zoletil® (Virbac, Carros, Франция) и общата телесна мазнина беше измерена чрез анализатор на телесния състав на малки животни, PIXImus (GE Healthcare, Little Chalfont, Великобритания). Черният дроб бързо се отстранява, претегля и замразява в течен азот за екстракция на РНК. Бялата и кафява мазнина също бяха отстранени, претеглени и замразени в течен азот. Протоколът за проучването е одобрен от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в болница Sendam National University Bundang, Seongnam, Република Корея (BA1012-074/068-1).

2.2. Измерване на телесно тегло и толерантност към глюкоза

Теглото на тялото се проследява всяка седмица. Приемът на храна се измерва на всеки 3 дни. Нивата на кръвната глюкоза се проверяват с реактивни ленти, отчетени в глюкомер (ACCU-CHEK Active, Roche, Mannheim, Германия). Тест за толерантност към интраперитонеална глюкоза се провежда след 12 часа на гладно чрез интраперитонеално инжектиране на 1 g/kg глюкоза на 12 седмици след експериментите. Нивата на глюкоза в кръвта от кръвта на опашната вена се определят с помощта на глюкомер преди и 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжектиране на глюкоза.

2.3. Измерване на липиден профил и инсулин

Общият серумен холестерол, триглицеридите, липопротеиновият холестерол с висока плътност и липопротеиновият холестерол с ниска плътност се определят с автоматична система за биохимичен анализ на Beckman Coulter AU480 (Brea, CA, USA) с комплекти реагенти, предоставени от производителя. За екстракция на липиди тъканите се изплакват с ледено студен PBS, за да се отстранят излишно кръвта и малки парченца и се хомогенизират в 100-200μL PBS със стъклен хомогенизатор върху лед. Получената суспензия се съхранява една нощ при -20 ° С. За по-нататъшно разбиване до клетъчните мембрани бяха проведени два цикъла на замразяване-размразяване. След това хомогенатите се центрофугират в продължение на 5 минути при 5000 х

. Супернатантата се използва за анализ. За анализ бяха използвани комплект за триглицеридни ELISA (Aviva Systems Biology, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и комплект за анализ на общ холестерол (BioVision Inc., Milpitas, CA). Инсулинът се измерва с помощта на миши инсулинов комплект ELISA (ALPCO Diagnostics, Windham, NH, USA) в съответствие с протокола на производителя.

2.4. Хистологичен анализ

Левите дялове на черния дроб бяха отстранени, изплакнати с PBS, фиксирани в 10% разтвор на формалдехид-PBS и вградени в парафин. Тканите бяха разделени на 5 μm дебелина и оцветени с хематоксилин и еозин.

2.5. Измерване на концентрацията на пиоглитазон

Концентрациите на пиоглитазон са анализирани чрез високоефективна течна хроматография (Agilent 1200 серия, Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Пиоглитазон хидрохлорид се разрежда в 50% ацетонитрил, за да се получи 100 μg/mL работен разтвор. Този работен разтвор се разрежда с празна плазма, за да се приготвят стандартни разтвори с различни концентрации (5, 10, 50, 100, 500, 1000 и 2000 ng/ml). Този стандартен разтвор (0,2 ml) се смесва с 10 μL от 1 μL/ml формотерол и 600 μL ацетонитрил и след това се центрофугира за 5 минути при 13 226 х. След това 100 μg/mL супернатант се смесва с 500 μL от 5 mM амониев формиат: ацетонитрил (20:80, 0,1% трифлуороцетна киселина). Тази смес (0.1 μL) се подлага на течна хроматография-масспектрометрия/масспектрометрия и графиките се анализират.

2.6. Изолация на РНК и количествена PCR в реално време
2.7. Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен чрез непараметричен анализ, използвайки теста на Ман-Уитни. Статистическата значимост беше приета при P +/ + и CAR -/- мишки (Фигура 1 (а)). Процентът на общите телесни мазнини се увеличава при лекувани с пиоглитазон CAR +/+ мишки, но този ефект е обърнат чрез делеция на CAR (Фигура 1 (b)). Количеството на приеманата храна е сходно между групите (показани данни). Чернодробното тегло не се различава между групите (Фигура 1 (в)). Въпреки че нивото на инсулин на гладно не показва значителна разлика (Фигура 1 (d)), лечението с пиоглитазон значително инхибира повишаването на нивото на кръвната глюкоза през всички времена при CAR -/- мишки и значително повишаване на кръвната глюкоза в CAR +/+ група мишки, с изключение на за 120 минути след натоварване с глюкоза (Фигура 1 (д)). Общите нива на серумния липопротеин и липопротеините с висока плътност са значително по-високи при CAR -/- мишки, отколкото при CAR +/+ мишки. Въпреки това, няма значителна промяна в липидните профили след лечение с пиоглитазон (Фигура 1 (f)). Чернодробният холестерол и триглицеридите също не се различават след лечение с пиоглитазон (Фигура 1 (g)).